中华预防医学杂志    2017年09期 2011—2015年北京5家哨点医院社区获得性肺炎病例中肺炎支原体流行特征及耐药情况    PDF     文章点击量:297    
中华预防医学杂志2017年09期
中华医学会主办。
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石伟先 吴双胜 龚成 李爱华 黄芳
ShiWeixian,WuShuangsheng,GongCheng,LiAihua,HuangFang
2011—2015年北京5家哨点医院社区获得性肺炎病例中肺炎支原体流行特征及耐药情况
The epidemiological characteristics and drug resistance of mycoplasma pneumoniae in patients with community-acquired pneumonia during 2011-2015 in 5 sentinel hospitals in Beijing
中华预防医学杂志, 2017,51(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.09.011

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投稿日期: 2017-01-14
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2011—2015年北京5家哨点医院社区获得性肺炎病例中肺炎支原体流行特征及耐药情况
石伟先 吴双胜 龚成 李爱华 黄芳     
石伟先 100013 北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所北京市预防医学研究中心
吴双胜 100013 北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所北京市预防医学研究中心
龚成 100013 北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所北京市预防医学研究中心
李爱华 100013 北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所北京市预防医学研究中心
黄芳 100013 北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所北京市预防医学研究中心;首都医科大学公共卫生学院
摘要: 目的  分析2011—2015年北京哨点医院社区获得性肺炎病例中肺炎支原体流行现况及耐药情况。方法  于2011年1月至2015年12月,以北京5家哨点医院中社区获得性肺炎病例为研究对象,收集其咽拭子、痰、鼻咽抽吸物等呼吸道样本,共2 272份。采用实时荧光PCR法,检测标本肺炎支原体感染情况;选取Ct值≤30的142份标本开展分离培养,对获得的肺炎支原体菌株进行基于P1基因序列分析的基因分型及基于体外药敏试验的耐药性检测。采用χ2检验比较不同年龄病例和不同时间发病病例肺炎支原体检出率差异。结果  2 272份样本的肺炎支原体检出率为13.6%(308例),其中5~14、15~24和≥60岁病例肺炎支原体检出率分别为24.4%(67/275)、24.4%(38/156)和3.9%(28/727)(χ2=1.22,P<0.001);2011—2015年发病病例肺炎支原体检出率分别为14.6%(73/501)、10.2%(36/353)、26.4%(101/383)、10.3%(41/398)和9.0%(57/637)(χ2=72.65,P<0.001);5年内,10—12月发病病例肺炎支原体检出率最高,为17.5%(122/699),4—6月最低,为8.6%(43/502)。基因分型结果显示,从142份咽拭子标本中共获得肺炎支原体菌株36株,P1-Ⅰ型为23株(63.9%),P1-Ⅱ型为13株(36.1%);所有菌株均对四环素及氟喹诺酮类药物左氧氟沙星、环丙沙星、氟哌酸均敏感;所有P1-Ⅱ型菌株均对大环内酯类药物敏感,但多数P1-Ⅰ型菌株(22株)对大环内酯类药物耐药。结论  2011—2015年北京社区获得性肺炎病例中5~14、15~24岁者是肺炎支原体感染的高发人群;其中2013年为高发年份,各季节均有散发;流行的基因型以P1-Ⅰ型为主且P1-Ⅰ型菌株多数对大环内酯类药物耐药。
关键词 :肺炎;支原体,肺炎;流行病学因素
The epidemiological characteristics and drug resistance of mycoplasma pneumoniae in patients with community-acquired pneumonia during 2011-2015 in 5 sentinel hospitals in Beijing
ShiWeixian,WuShuangsheng,GongCheng,LiAihua,HuangFang     
Beijing Centers For Disease Control & Prevention, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 100013, China
Corresponding author: Huang Fang, Email: hhffxdd@126.com
Abstract:Objective  To analyze the prevalence and drug resistance of mycoplasma pneumoniae in patients with community-acquired pneumonia during 2011-2015 in Beijing.Methods  Totally 2 272 mycoplasma pneumoniae samples were collected from patients with community-acquired pneumonia in 5 sentinel hospitals during 2011-2015. Mycoplasma pneumoniae were detected by real-time PCR. 142 copies of positive samples with Ct value under 30 were cultured to get the strains so that the genotypes based on the P1 gene sequence and the drug resistance based on the in vitro drug resistance test could be conducted. χ2 test was used to compare the detection rates of mycoplasma pneumoniae among different age groups and different onset-phase.Results  The positive rate of mycoplasma pneumoniae was 13.6%(308 cases). The positive rate in groups aging (5-14), (15-24) and ≥60 years old were separately 24.4% (67/275), 24.4% (38/156) and 3.9% (28/727) (χ2=1.22, P<0.001). The annual detection rate of mycoplasma pneumoniae in 2011-2015 were 14.6% (73/501), 10.2% (36/353), 26.4% (101/383), 10.3% (41/398), 9.0% (57/637),respectively (χ2=72.65, P<0.001). Seasonally, the peak of positive rate was between October and December (17.5%, 122/699) and the lowest positive rate was between April and June (8.6%, 43/502). 36 strains were isolated from 142 swabs and 23 (63.9%) were P1-Ⅰ and 13 (36.1%) were P1-Ⅱ by genotyping. All isolates were susceptible to the fluoroquinolones (levofloxacin, ciprofloxacin, and gatifloxacin) and tetracycline. All P1-Ⅱ strains were susceptible to macrolides while most of the P1-Ⅰ strains (22 strains) were macrolide-resistant.Conclusion  People aging (5-14) and (15-24) years old were more susceptible to mycoplasma pneumoniae in patients with community-acquired pneumonia in Beijing between 2011 and 2015. The highest positive rate of mycoplasma pneumoniae was in 2013 and the case distributed in all seasons. The major popular genotype was P1-Ⅰ, whose strains were mostly macrolide-resistant.
Key words :Patients with community-acquired pneumonia;Mycoplasma pneumoniae;Epidemic characteristics
全文

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是引起人类呼吸道感染的重要致病原之一,人群普遍易感,且易导致聚集性流行[1]。既往研究发现肺炎支原体具有每3~7年周期性暴发流行规律[1],依据P1基因对肺炎支原体进行基因分型研究可了解肺炎支原体周期性暴发流行的分子机制[2]。近年来因肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药率急剧增加[3],对其耐药性开展监测是临床救治及防控措施制定的重要依据。本研究通过对2011—2015年期间对北京5家哨点医院的不同年龄段人群社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)病例样本进行肺炎支原体筛查、分离培养、耐药性监测,探索北京近年来肺炎支原体流行规律、耐药性与基因型分布的相关性,为北京肺炎支原体防控提供科学依据,并对其暴发流行提供预测预警。

材料与方法  

1.标本来源:  依据社区获得性肺炎诊断标准[4],于2011年1月至2015年12月,以北京隆福医院、垂杨柳医院、东方医院、顺义区医院、潞河医院等5家哨点医院的发热门诊、儿科门诊、急诊、呼吸内科病房、儿科病房、ICU等诊室中,在社区发病、有肺实变体征和(或)闻及湿啰音或有胸部影像学诊断为社区获得性肺炎病例为研究对象。每家哨点医院每月采集5~10例病例的咽拭子、痰、鼻咽抽吸物等呼吸道样本,并于4 ℃保存,5 h内送至实验室,待检,共2 272份。本研究通过中国医科院病原生物学研究所伦理委员会的审查(批号:IPB-2014-4),采集样本前均征得病例知情同意。

2.核酸提取:  采用德国QIAGEN公司生产的QIAamp DNA MINIKIT试剂盒,按试剂盒说明书提取核酸。

3.肺炎支原体实时荧光PCR检测:  引物与探针序列参照文献[5],25 μl检测体系包含:0.25 μl Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen C10966-034),12.5 μl Platinum quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen C11730-025),1.5 μl MgCl2(50 mmol/L),0.5 μl上游引物RepMP-F(25 μmol/L),0.5 μl下游引物RepMP-R(25 μmol/L),0.2 μl探针RepMP-P(25 μmol/L),1.5 μl PCR nucleotide mix (Promega C1141),5 μl DNA模板,用Nuclease-free water (Promega P1193)补至25 μl。使用BIO-RAD C1000 Thermal Cycler real-time PCR仪进行扩增,扩增条件为:95 ℃ 2 min;然后95 ℃ 15 s,57 ℃ 30 s,40个循环。记录阳性结果的Ct值。

4.肺炎支原体分离、培养和DNA提取:  选取实时荧光PCR法检测Ct值≤30的肺炎支原体阳性咽拭子标本,共142份,使用2 ml肺炎支原体选择性液体培养基(美国Oxoid公司CM0403、SR0059)培养标本,每日观察培养基变色情况,如培养基48 h内发生浑浊,提示细菌污染,则丢弃,将备份标本经450 nm滤器过滤后重新培养观察,培养基变黄提示培养阳性,记录培养阳性变色日期,连续观察30 d仍未变色的标本为培养阴性。培养变色的阳性标本接种肺炎支原体固体培养基分纯培养,挑取单克隆再经液体分纯培养后增菌。纯培养物使用提取核酸使用实时荧光PCR进行肺炎支原体鉴定[5]

5.基于P1基因序列分析的基因分型:  用德国Qiagen公司生产的QIAamp DNA MINIKIT试剂盒提取菌株DNA,参照文献[6]首先扩增出P1基因上RepMP4(ADH12)和RepMP2/3(ADH34)区,Invitrogen公司产Platium? Taq polymerase,引物由北京六和通生物有限公司合成,使用ABI 9700,扩增条件如下:95 ℃ 2 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s和72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 5 min延伸。扩增产物ADH12稀释后作为模板,使用ADH12-432(GAAGTTAAACCCGCAAACGC)和ADH12-1243(CACGGTTTGTGGGACTGAAAG)引物进行巢式PCR扩增;扩增产物ADH34稀释后使用ADH34-2581(CCTCAAAGCGAATGTCCAAGC)和ADH34-3202(TCCAACACGACCAGTTCACCC)引物进行巢式PCR扩增,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳确认条带大小后送交生工生物有限公司测序,序列经BLAST比对后确定相应菌株的基因型。

6.体外药敏试验:  红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星及氟哌酸均购自美国Sigma公司,对大环内酯类药物敏感的标准株M129 (ATCC 29342)及耐药株ICDCP028为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病诊断室惠赠。药敏试验采用微孔稀释法,结果判读参照美国临床实验室标准化协会2011年版支原体抗生素药敏试验操作标准[7]进行。每种抗生素浓度重复3孔,37 ℃培养7 d,观察培养基颜色变化,变色孔相应的抗生素最低浓度作为最低抑菌浓度。

7.统计学分析:  采用SPSS 19.0建立数据库并进行统计学分析。采用χ2检验比较不同特征病例MP检出率以及不同特征阳性咽拭子标本中肺炎支原体菌株阳性率差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.基本情况:  2 272例病例中,肺炎支原体检出率为13.6%(308例),其中,男、女病例检出率分别为12.2%(168/1 372)、15.6%(140/900)(χ2=5.08,P=0.024)。不同哨点医院所采集样本的检出率差异有统计学意义。详见表1

表12011—2015年北京5家哨点医院内社区获得性肺炎病例肺炎支原体检出率比较

2.年龄与时间分布:  (1)年龄分布:5~14与15~24岁病例肺炎支原体检出率较高,≥60岁病例检出率最低,差异有统计学意义。(2)时间分布:2013年发病病例肺炎支原体检出率最高,2015年最低,不同年份发病病例肺炎支原体检出率差异有统计学意义。2011—2015年,4—6月发病病例肺炎支原体检出率最低,10—12月检出率最高,差异有统计学意义。由于2013年7—12月发病病例肺炎支原体检出率高于其他年份的相应月份,因此不考虑2013年数据时,其他年份中不同月份合计肺炎支原体检出率差异无统计学意义(χ2=5.51,P=0.140);2013年不同月份肺炎支原体检出率差异有统计学意义。详见表1

3.不同来源咽拭子标本的肺炎支原体菌株分离情况:  共得到肺炎支原体咽拭子标本142份,经分离培养及实时荧光PCR方法确认,分离得到肺炎支原体菌株36株(25.4%)。来源于不同哨点医院、不同年龄病例、不同年份发病病例标本分离菌株情况差异均有统计学意义。详见表2

表22011—2015年北京5家哨点医院内社区获得性肺炎病例肺炎支原体菌株阳性及基因分型情况

4.肺炎支原体菌株基因分型情况:  36株肺炎支原体菌株中,23株(63.9%)为P1-Ⅰ型,13株(36.1%)为P1-Ⅱ型。详见表2。不同年份P1-Ⅰ型菌株分离率差异有统计学意义(χ2=5.79,P=0.016),P1-Ⅱ型菌株分离率差异无统计学意义(χ2=0.58,P=0.516)。

5.肺炎支原体菌株的耐药情况:  36株菌株对四环素及氟喹诺酮类药物左氧氟沙星、环丙沙星、氟哌酸均敏感,13株P1-Ⅱ型菌株及1株P1-Ⅰ型菌株对大环内酯类药物敏感,而22株P1-Ⅰ型菌株则对大环内酯类药物均表现为耐药,其中对红霉素最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值≥128 μg/ml,对克拉霉素MIC值≥128 μg/ml,对阿奇霉素MIC值≥16 μg/ml,对交沙霉素MIC值≥1 μg/ml。详见表3

表32011—2015年北京5家哨点医院内36株肺炎支原体菌株对不同抗生素耐药的最低抑菌浓度(μg/ml)

讨论  支原体肺炎发病率在不同国家、不同地区、不同年份及季节、不同人群中差异较大(9.6%~66.7%)[1,8],在5岁及以上肺炎患儿中,其感染率可达50%[9],是儿童肺炎的重要致病原。本研究结果亦显示,在5~14岁儿童中肺炎支原体的感染率远高于60岁及以上及4岁以下婴幼儿人群,但同时不能忽略,在15~24岁人群中也有较高的检出率。
        考虑到北京三级医院的外地病例、重症病例较多,且CAP病例可能存在城郊差异,本研究选取的哨点医院均为该行政区二级医院,分别为位于北京城区和郊区。其中隆福医院的检出阳性率明显低于其他哨点医院,其原因为该院所采集病例中73.6%为60岁及以上病例,而该年龄组肺炎支原体阳性检出率较低。
        肺炎支原体全年散发,每3~7年出现一次流行高峰[1],北京年度、季节性流行规律尚无报道。本研究结果显示,北京肺炎支原体检出阳性率在夏秋季及秋冬季较高。2011—2015年期间,2013年7—12月份肺炎支原体检出阳性率明显高于其他年份,是否表明北京年度流行规律为每隔3年会出现一个流行高峰,仍需进一步的监测数据支持。
        P1基因是肺炎支原体最重要的黏附蛋白与毒力因子,根据P1基因序列,可将肺炎支原体分为P1-Ⅰ型和P1-Ⅱ型[6]。近年有研究结果发现,存在不同型别的交替流行。Sasaki等[6]对日本神奈川县肺炎支原体分型结果分析显示1979—1980年全部样本为P1-Ⅱ型,自1983年开始向P1-Ⅰ转变,1985—1991年期间则以P1-Ⅰ型为优势菌株,随后几年又逐渐向PI-Ⅱ型转变。浙江大学医学院儿童医院研究表明,2009年期间该院住院患儿中肺炎支原体感染以P1-Ⅰ型为主[10],北京首都儿科研究所附属儿童医院的研究结果也表明,2010—2012年该院住院患儿中肺炎支原体感染的主要基因型为P1-Ⅰ型[11]。本研究结果显示,2011—2015年P1-Ⅰ型与P1-Ⅱ型在各年间均有检出,但P1-Ⅰ型菌株阳性检出率呈现逐年降低趋势,而P1-Ⅱ型则保持平稳。2013年肺炎支原体阳性检出率出现了明显高峰,以P1-Ⅰ型为主,但肺炎支原体的流行高峰年是否与流行基因型相关,仍需进一步研究。
        由于本研究采用对菌株进行分析,虽结果明确,但因需分离培养,对于分离失败的临床样本无法获得分型结果,从而影响数据分析。直接由临床样本中获得基因分型结果是多年来大家所关注的方向,目前已取得一定进展[12],在以后的研究中本实验室将建立并应用该方法,以期获得更完整的数据。
        用于治疗支原体肺炎的药物,目前主要为大环内酯类及喹诺酮类药物,随着大环内酯类药物在临床上的广泛应用,我国肺炎支原体耐药株快速增加,且耐药率大大高于欧美等国,Zhao等[13]报道,2008—2012年间北京地区耐药率分别为68.9%、90%、98.4%、95.4%及97%;Liu等[14]在2009年报道上海地区耐药率为83%,欧美各国耐药率则均低于10%[15],日本2000—2006年耐药率从0上升至30.6%[15]。不同大环内酯类药物化学结构有所差异,红霉素和克拉霉素为14元环,阿奇霉素为15元环,交沙霉素为16元环,本研究中22株P1-Ⅰ型菌株对红霉素和克拉霉素最低抑菌浓度值最高,为≥128 μg/ml,对交沙霉素最低抑菌浓度值最低,为1~8 μg/ml,表明16元环大环内酯类药物比14和15元环大环内酯类更有效。

参考文献
[1]陆权,陆敏.肺炎支原体感染的流行病学[J].实用儿科临床杂志,2007,22(4):241-243. DOI: 10.3969/j.issn.1003-515X.2007.04.001.
[2]Dorigo-ZetsmaJW, DankertJ, ZaatSA. Genotyping of Mycoplasma pneumoniae clinical isolates reveals eight P1 subtypes within two genomic groups[J]. J Clin Microbiol, 2000,38(3):965-970.
[3]李少丽,孙红妹.肺炎支原体的耐药机制和耐药基因检测现状[J].国际呼吸杂志,2010,30(16):989-993. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-436X.2010.016.008.
[4]中华医学会呼吸病学会分会.社区获得性肺炎诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2006, 29(10):651-655.DOI:10.3760/j:issn:1001-0939.2006.10.002.
[5]DumkeR, SchurwanzN, LenzM, et al. Sensitive detection of Mycoplasma pneumoniae in human respiratory tract samples by optimized real-time PCR approach[J]. J Clin Microbiol, 2007,45(8):2726-2730. DOI: 10.1128/JCM.00321-07.
[6]SasakiT, KenriT, OkazakiN, et al. Epidemiological study of Mycoplasma pneumoniae infections in japan based on PCR-restriction fragment length polymorphism of the P1 cytadhesin gene[J]. J Clin Microbiol, 1996,34(2):447-449.
[7]Chang-taiZ, Zhong-yiH, Chun-leiD, et al. Investigation of Ureaplasma urealyticum biovars and their relationship with antimicrobial resistance[J]. Indian J Med Microbiol, 2011,29(3):288-292. DOI: 10.4103/0255-0857.83915.
[8]刘慧,肖新才,陆剑云,等. 2009—2012年广州市社区获得性肺炎流行特征和病原学研究[J].中华预防医学杂志,2013,47(12):1089-1094. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2013.12.005.
[9]VervloetLA, MarguetC, CamargosPA. Infection by Mycoplasma pneumoniae and its importance as an etiological agent in childhood community-acquired pneumonias[J]. Braz J Infect Dis, 2007,11(5):507-514.
[10]张立,陈志敏,沈征,等.浙江省儿童鼻咽吸出物标本肺炎支原体基因分型研究[J].中华儿科杂志,2011,49(10):750-754. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2011.10.009.
[11]孙红妹,薛冠华,闫超,等. 2010—2012年北京地区儿童肺炎支原体流行基因型监测[J].中华微生物学和免疫学杂志,2012,32(11):939-943. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2012.11.004.
[12]ZhaoF, LiuL, TaoX, et al. Culture-Independent Detection and Genotyping of Mycoplasma pneumoniae in Clinical Specimens from Beijing, China[J]. PLoS One, 2015,10(10):e0141702. DOI: 10.1371/journal.pone.0141702.
[13]ZhaoF, LiuG, WuJ, et al. Surveillance of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae in Beijing, China, from 2008 to 2012[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013,57(3):1521-1523. DOI: 10.1128/AAC.02060-12.
[14]LiuY, YeX, ZhangH, et al. Antimicrobial susceptibility of Mycoplasma pneumoniae isolates and molecular analysis of macrolide-resistant strains from Shanghai, China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009,53(5):2160-2162. DOI: 10.1128/AAC.01684-08.
[15]董艳青,辛德莉.肺炎支原体的耐药现状[J].中国全科医学,2013,16(32):3770-3773,3777.DOI:10.3969/j.issn.1007-9572.2013.32.003.