中华预防医学杂志    2017年09期 A激酶锚定蛋白12基因甲基化与原发性肝癌复发的关系研究    PDF     文章点击量:241    
中华预防医学杂志2017年09期
中华医学会主办。
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刘兆君 刘伟 崔成华 谷连坤 邢宝才 邓大君
LiuZhaojun,LiuWei,CuiChenghua,GuLiankun,XingBaocai,DengDajun
A激酶锚定蛋白12基因甲基化与原发性肝癌复发的关系研究
Association between A-kinase anchor proteins 12 methylation and recurrence of hepatocellular carcinoma
中华预防医学杂志, 2017,51(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.09.014

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投稿日期: 2017-05-09
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A激酶锚定蛋白12基因甲基化与原发性肝癌复发的关系研究
刘兆君 刘伟 崔成华 谷连坤 邢宝才 邓大君     
刘兆君 100142 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,病因学研究室
刘伟 100142 北京大学肿瘤医院肝胆胰外一科
崔成华 100142 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,病因学研究室
谷连坤 100142 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,病因学研究室
邢宝才 100142 北京大学肿瘤医院肝胆胰外一科
邓大君 100142 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,病因学研究室
摘要: 目的  探讨A激酶锚定蛋白12(AKAP12)甲基化与原发性肝癌复发的关系。方法  于2003—2009年,以在北京大学肿瘤医院肝胆外科接受手术治疗的原发性肝癌患者作为研究对象,对其进行≥3年的随访。纳入标准:肝细胞癌患者,经鉴定切缘组织无肿瘤细胞存在;手术时无淋巴结转移及远处转移;有完整的临床资料,共142例。截至2014年5月随访结束,共有75例研究对象复发,其中71例死亡,无失访。从冰冻手术标本中获取研究对象的肿瘤组织及切缘组织,采用酚-氯仿法提取DNA并修饰后进行PCR扩增,对PCR产物进行克隆并测序分析,应用变性高效液相色谱检测研究对象肿瘤组织和肿瘤旁切缘正常组织AKAP12基因的甲基化状态。采用Log-rank检验对研究对象生存时间进行单因素分析;采用多因素Cox比例风险模型分析研究对象生存时间差异的影响因素。结果  142例研究对象中,男性125例(88.0%),年龄为34~76岁,中位年龄是52.5岁。肿瘤组织中AKAP12甲基化阳性率(54.9%,78/142)高于切缘组织中AKAP12甲基化阳性率(10.2%,6/59)。与AKAP12甲基化阴性者相比,AKAP12甲基化阳性者原发性肝癌复发风险较低HR=0.62,95%CI:0.39~0.99;与肿瘤直径≤5 cm者相比,肿瘤直径>5 cm者原发性肝癌复发风险较高HR=1.53,95%CI:1.00~2.50;与无门脉侵犯者相比,有门脉侵犯者原发性肝癌复发风险较高HR=4.53,95%CI:2.69~7.64。与无门脉侵犯者相比,有门脉侵犯者死亡风险较高HR=2.98,95%CI:1.73~4.98。结论  AKAP12甲基化与原发性肝癌的复发及无疾病生存时间相关。
关键词 :肝肿瘤;DNA甲基化;复发;AKAP12
Association between A-kinase anchor proteins 12 methylation and recurrence of hepatocellular carcinoma
LiuZhaojun,LiuWei,CuiChenghua,GuLiankun,XingBaocai,DengDajun     
Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research (Ministry of Education), Peking University Cancer Hospital & Institute, Beijing 100142, China
Corresponding author: Deng Dajun, Email: dengdajun@bjmu.edu.cn
Abstract:Objective  To study the association between the AKAP12 promoter methylation and recurrence of hepatocellular carcinoma.Methods  A total of 142 primary liver cancer patients underwent surgery in department of Hepatobiliary surgery in Peking University Cancer Hospital from 2003 to 2009 were selected as subjects in the survey; with the inclusion criteria as hepatocellular carcinoma, no cancer cells were observed in the surgical margin(SM) samples. All patients had neither lymph nor distant metastasis at the time of surgery, and receiving complete follow-up data for at least 3 years. By the end of May 2014, a total of 75 patients had relapsed of whom 71 died and there were no lost. All samples were acquired from the frozen surgical tissues. Genomic DNA was extracted using phenol/chloroform method and performed bisulfite modification following with polymerase chain reaction (PCR). AKAP12 methylation in hepatoma and the corresponding SM samples from 142 patients was determined by denature high-performance liquid chromatography (DHPLC) and bisulfite clone sequencing. Kaplan-Meier and Cox proportion hazard regression model were used to identify the factors related to the survival time.Results  In 142 cases, 125 patients (88.0%) were male and 17 (12.0%) cases were female. The median age was 52.5 years, ranging from 34 years to 76 years. AKAP12 methylation-positive rate was significantly higher in hepatomas than SMs (54.9% vs. 10.2%, P<0.001). Patients with AKAP12 methylation-positive had less risk of the recurrence (HR=0.62, 95%CI: 0.39-0.99); with tumor diameter more than 5 cm (HR=1.53, 95%CI: 1.00-2.50),portal vein invasion(HR=4.53, 95% CI:2.69-7.64) increased the recurrence risk. Moreover, portal vein invasion had a higher risk of death (HR=2.98, 95% CI: 1.73-4.98).Conclusion  There was significant association between AKAP12 DNA methylation and low risk of recurrence and long progression-free survival of hepatocellular carcinoma patients.
Key words :Liver neoplasms;DNA methylation;Recurrence;AKAP12
全文

原发性肝癌是常见恶性肿瘤之一,发病例数占2012年全球和中国癌症总数的5.6%和12.9%[1]。肝癌的5年复发率达70%~80%,是致死率最高的肿瘤之一[2]。发现肝癌复发预测分子标志物不仅有助于预后判断,还有助于发现治疗新靶标。作为蛋白激酶A及蛋白激酶C的组成部分,A激酶锚定蛋白12(A-kinase anchor proteins,AKAP12)是A型激酶锚定蛋白家族的一员,在各种正常上皮组织中表达。近年来发现,AKAP12在多种恶性肿瘤中表达下调,可能与肿瘤发生发展有关[3]。AKAP12在肝癌组织中表达降低且受DNA甲基化调控[4]。Cui等[5]研究结果发现肝癌复发相关DNA甲基化组时发现,与源自同一患者的复发性肝癌细胞系相比,未复发的肝癌细胞中AKAP12基因甲基化程度高。本研究分析了AKAP12甲基化与原发性肝癌随访复发、患者无病生存期(disease free survival, DFS)及总生存期(overall survival, OS)的关系,为判断其能否作为预测肝癌复发的分子标志物提供科学依据。

对象与方法  

1.对象:  本研究为基于医院病例的前瞻性队列研究。于2003—2009年,选择在北京大学肿瘤医院肝胆外科接受手术治疗的原发性肝癌患者作为研究对象。纳入标准:肝细胞癌患者,经鉴定切缘组织无肿瘤细胞存在;手术时无淋巴结转移及远处转移(TNM分期:T1-3N0M0);有完整的临床资料。肝癌组织及切缘组织均从冰冻手术标本获取。基线时共纳入研究对象142例,对其进行≥3年的随访。截至2014年5月随访结束,共有75例研究对象复发,其中71例死亡,无失访。分别计算患者的无病生存期(从接受手术治疗到肿瘤复发的时间)和总生存期(从接受手术治疗到患者因肿瘤死亡的时间)。本研究经北京大学肿瘤医院伦理委员会批准(批号:2015KT03),所有研究对象均签署知情同意书。

2. DNA提取及亚硫酸氢盐修饰:  DNA均采用酚-氯仿法提取[6],亚硫酸氢钠修饰按参考文献[7]报道方法进行。主要过程如下:1.8 μg DNA用10 mmol/L的氢醌和3 mol/L的亚硫酸氢钠修饰后,于37 ℃水浴中放置处理16 h;然后用Wizard DNA纯化试剂盒(美国Promega公司)纯化DNA,于-20 ℃酒精沉淀4 h后,最终溶于20 μl Tris-EDTA(TE)缓冲液中,-20 ℃保存。

3. PCR扩增:  用正向引物(5'-GAAGT TTTTG TTTTG GGTGA TTT-3')和反向引物(5'-AAAAA ACCAC CTCTT AACCT CC-3')扩增AKAP12第一外显子区CpG岛序列,片段长度为317 bp。PCR反应体系:30 μl,含50 ng修饰后DNA模板, 0.15 mmol/L dNTP, 0.15 mol/L引物,0.9 U热启动Taq DNA聚合酶(德国Qiagen公司);PCR扩增条件:预变性95 ℃ 15 min,95 ℃变性30 s,58.5 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环,72 ℃最终延伸10 min。

4.变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)分析测定:  利用WAVE核苷酸片段分析系统(美国Transgenomic公司)在58.2 ℃变性温度条件下对上述PCR样品进行DHPLC分离[8],用荧光检测器检测,以3倍信噪比(3S/N)作为判断结果的最低检出限,检测峰高高于3S/N判定为甲基化阳性。用甲基化色谱峰面积与甲基化及非甲基化色谱峰总面积比值计算甲基化位点的百分比/含量[9]

5.克隆测序:  利用AT clone Kit(美国Promega公司)对PCR产物进行克隆,然后用ABI 3730 Analyzer(美国ABI公司)进行测序分析。

6.质量控制:  研究对象DNA提取后,利用NanoVue Plus紫外可见光分光光度计(美国GE公司)测定,采用样品OD260/OD280在1.8~2.0之间者,保证DNA的纯度。DHPLC检测AKAP12基因甲基化时,利用正常人外周血DNA及CpG甲基转移酶修饰的正常人外周血DNA分别作为阴性对照和阳性对照,保证测定结果的真实性。采用盲法双录入的形式录入资料并及时核查,保证录入质量。

7.统计学分析:  用Excel 2013软件进行数据录入和数据管理,录入过程中采用平行双录入。采用SPSS 16.0软件进行统计分析。AKAP12甲基化含量符合正态分布,用±s表示;年龄、随访中位时间、DFS和OS均为偏态分布,采用P50P25~P75)表示。采用t检验比较各亚组AKAP12甲基化阳性样品的AKAP12甲基化百分含量差异;采用χ2检验比较AKAP12甲基化在不同病例特征之间的差异;采用Log-rank检验对研究对象生存时间进行单因素分析;将各变量引入Cox比例风险模型,采用前进法进行多因素分析,变量进入多因素Cox模型的纳入标准为α=0.05,排除标准为β=0.10。

结果  

1.基本情况:  142例研究对象中,男性125例(88.0%),年龄为34~76岁,中位年龄是52.5岁。其中137例(96.5%)感染了HBV。142例随访对象随访时间的P50P25~P75)为48.0(26.0~64.3)个月,DFS和OS的中位数分别为34.0个月和48.0个月。

2.不同特征研究对象肿瘤组织中AKAP12甲基化含量及阳性率比较:  肿瘤组织中AKAP12甲基化阳性率(54.9%,78/142)高于切缘组织(10.2%,6/59)。年龄>50岁的患者肿瘤组织AKAP12甲基化阳性率(62.1%)高于50岁及以下的患者(43.6%);肿瘤直径≤5 cm的患者肿瘤组织中AKAP12甲基化阳性率(63.8%)高于直径>5 cm患者(43.5%);以上差异均有统计学意义。不同特征患者肿瘤组织中AKAP12甲基化百分含量差异均无统计学意义。详见表1

表1142例原发性肝癌患者肿瘤组织中AKAP12甲基化含量及阳性率比较

3.影响不同特征原发性肝癌患者DFS、OS的单因素分析:  AKAP12甲基化阳性患者术后DFS较长(Log-rank检验,P=0.031)。肿瘤直径≤5 cm和无门脉侵犯的患者术后DFS和OS均较长(P值均<0.05)。详见表2

表2影响142例原发性肝癌患者无病生存期和总生存期的单因素分析

4.影响不同特征原发性肝癌患者DFS、OS的多因素Cox比例风险模型分析:  (1)DFS:与AKAP12甲基化阴性患者相比,AKAP12甲基化阳性患者的复发风险较低;与肿瘤直径≤5 cm患者相比,肿瘤直径>5 cm的患者复发风险较高;与无门脉侵犯患者相比,有门脉侵犯的患者复发风险较高,以上差异均有统计学意义(P值均<0.05)。详见表3。(2)OS:与无门脉侵犯患者相比,有门脉侵犯的患者死亡风险较高,差异具有统计学意义(P<0.05);与AKAP12甲基化阴性患者相比,AKAP12甲基化阳性患者的死亡风险没有降低(P>0.05)。详见表4

表3影响原发性肝癌患者无病生存期的多因素Cox比例风险模型分析
表4影响原发性肝癌患者总生存期的多因素Cox比例风险模型分析

讨论  原发性肝癌是危害中国居民健康的恶性肿瘤之一,位居恶性肿瘤死因顺位的第2位[10]。复发是肝癌患者死亡的主要原因,如果在肿瘤患者术后或化疗前预测出其转移复发的潜能,就有可能为术后辅助治疗提供科学指导,对提高患者的生存率和生活质量有重要意义[11]。本研究通过对142例原发性肝癌患者进行分析,首次评价了AKAP12甲基化与原发性肝癌复发及预后的关系,发现AKAP12甲基化阳性可以降低原发性肝癌复发风险,延长患者生存时间,是判断肝癌患者预后的独立因素。
        多个研究结果显示,AKAP12基因在包括肝癌在内的多种肿瘤组织(胃癌、食管癌、肺癌、前列腺癌等)中异常高甲基化失活[3,4,12,13,14,15,16]。本研究结果显示,肝癌组织中AKAP12甲基化阳性率显著高于切缘组织,与以往报道一致[4]。Aguirre-Gamboa等[17]的研究结果显示,在381例原发性肝癌患者中,AKAP12低表达的肝癌患者(232例)术后总生存时间长于AKAP12高表达的肝癌患者(HR=0.71,95% CI:0.512~0.997,P=0.046),提示AKAP12高表达预测原发性肝癌的不良预后。AKAP12甲基化的存在意味着表达水平低,Jo等[18]在肺癌组织中的研究发现,相对于复发组患者来说,非复发性组患者AKAP12的甲基化频率更高。
        多因素分析结果显示,除了不同AKAP12基因甲基化状态患者的无疾病生存时间的差异有统计学意义,肿瘤直径>5 cm及有门脉侵犯的患者复发风险提高,且有门脉侵犯者死亡风险也高。有研究结果显示门脉侵犯是原发性肝癌患者长期生存的独立危险因素[19,20],与本研究的结果一致。门脉侵犯是影响肝癌患者预后的独立危险因素之一,肝癌血管的特殊性可导致癌细胞侵及门静脉及肝静脉血管,当影像学诊断或术后病理诊断发现门静脉或肝静脉癌栓时,提示有癌细胞肝内转移的可能,预后差[21]。单因素分析时,不同肿瘤直径大小患者的生存时间差异有统计学意义,但在多因素分析时差异无统计学意义,这与Goh等[22]研究结果一致,原因可能是有些患者虽然肿瘤较小但早期已经发生肝内或肝外转移[23]。AKAP12有两个剪切体AKAP12α和AKAP12β,原发性肝癌中AKAP12α表达主要受DNA甲基化调控,而AKAP12β则受miRNA的影响[4],故本研究主要分析了AKAP12α启动子区甲基化的情况。由于在肝癌中AKAP12的表达受甲基化调控、基因缺失、miRNA等多种因素影响[4],在结果分析上相对复杂,故本研究中单纯分析AKAP12启动子甲基化,而未再进一步分析其表达水平的改变。另外,本研究中AKAP12甲基化不同状态患者的术后总生存期的差异无统计学意义,可能与纳入的样本量少有关,未来需要多中心、更大样本量的独立研究进行验证。

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