中华预防医学杂志    2017年10期 2013—2015年郑州67株甲型副伤寒沙门菌分子分型与耐药研究    PDF     文章点击量:207    
中华预防医学杂志2017年10期
中华医学会主办。
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赵嘉咏 张胜勇 张白帆 穆玉姣 苏佳 黄学勇 许汴利
ZhaoJiayong,ZhangShengyong,ZhangBaifan,MuYujiao,SuJia,HuangXueyong,XuBianli
2013—2015年郑州67株甲型副伤寒沙门菌分子分型与耐药研究
Characteristics of molecular typing and drug resistance of 67 Salmonella paratyphi A isolated in Zhengzhou from 2013 to 2015
中华预防医学杂志, 2017,51(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.10.003

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投稿日期: 2017-03-26
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2013—2015年郑州67株甲型副伤寒沙门菌分子分型与耐药研究
赵嘉咏 张胜勇 张白帆 穆玉姣 苏佳 黄学勇 许汴利     
赵嘉咏 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
张胜勇 登封市疾病预防控制中心检验科
张白帆 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
穆玉姣 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
苏佳 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
黄学勇 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
许汴利 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
摘要: 目的  分析2013—2015年郑州甲型副伤寒沙门菌临床分离株的耐药状况与脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子型别特征。方法  于2013—2015年,从郑州发热伴出疹症候群监测系统2个哨点医院内,分离经病例血培养和粪便培养的67株甲型副伤寒沙门菌,其中2013年11株,2014年7株,2015年49株。根据国际PulseNet网络实验室公布的沙门菌PFGE分型操作规程与美国临床实验室标准化协会沙门菌K-B法药敏试验方案,对67株甲型副伤寒沙门菌进行药敏试验与PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型分析。结果  67株甲型副伤寒沙门菌对13种抗生素均有不同程度的耐药,有65株为多重耐药株(97.0%),其中耐2~3种的为5株(7.5%),耐5~8种的为41株(61.2%),耐9~10种的为11株(16.4%),耐11~12种的为8株(11.9%)。经XbaⅠ酶切与脉冲场凝胶电泳后,67株甲型副伤寒沙门菌共获得10种带型(PTYA1~10),每种带型包含1~48株菌株,相似度为94.31%~100%。其中PTYA3包含48株菌,为其优势带型;PTYA1、9包含6株菌;PTYA2、4、5、6、7、8、10各包含1株菌。结论  郑州市临床分离的甲型副伤寒沙门菌耐药状况普遍比较严重,PFGE带型呈现多样性的同时又具有较显著的优势带型特点,部分带型与其对应的耐药谱具有一定的关联性与聚集性。
关键词 :沙门菌,甲型副伤寒;电泳,凝胶,脉冲场;抗药性
Characteristics of molecular typing and drug resistance of 67 Salmonella paratyphi A isolated in Zhengzhou from 2013 to 2015
ZhaoJiayong,ZhangShengyong,ZhangBaifan,MuYujiao,SuJia,HuangXueyong,XuBianli     
Institute for Infectious Disease Control and Prevention, Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Zhengzhou 450016, China
Corresponding author: Xu Bianli, Email:xubl@hncdc.com.cn
Abstract:Objective  To investigate the antimicrobial resistance and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) patterns of S.paratyphi A strains in Zhengzhou city isolated from sentinel hospitals in 2013-2015.Methods  According to Salmonella molecular typing and K-B drug susceptibility testing method published by international PulseNet bacterial infectious disease monitoring network and USA Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI2015), we analyzed drug sensitivity and PFGE molecular characteristics of 67 S.paratyphi A strains(11 strains in 2013, 7 strains in 2014, 49 strains in 2015) isolated from blood and stool samples in two sentinel hospitals of fever with rash syndrome surveillance system established in Zhengzhou city in 2013-2015.Results  The results showed 67 strains of S.paratyphi A had different levels of resistance to 13 kinds of antibiotics, 65 strains were multi-drug resistant strains (97.0%), 5 isolates were resistant to 2-3 kinds of antibiotics (7.5%), 41 isolates were resistant to 5-8 kinds of antibiotics (61.2%),11 isolates were resistant to 9-10 kinds of antibiotics(16.4%),8 isolates were resistant to 11-12 kinds of antibiotics(11.9%). 67 strains of S.paratyphi A were divided into 10 molecular patterns(PTYA1-PTYA10) by digestion with XbaⅠ restriction endonuclease and pulsed field gel electrophoresis, each pattern contains 1-48 strains with similarity ranged from 94.31%-100%. PTYA3 contained 48 strains, which was predominant band type; PTYA1, 9 contained 6 strains; PTYA 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10 contained 1 strains among them.Conclusion  The status of drug resistance of clinical isolates of S.paratyphi A in Zhengzhou city was rather serious, PFGE patterns showed diversity and dominant characteristics. The PFGE patterns of partial strains and its corresponding anti-drug spectrum have certain relevance and cluster relationship.
Key words :Salmonella paratyphi A;Electrophoresis, gel, pulsed-field;Drug resistance
全文

甲型副伤寒是由甲型副伤寒沙门菌引起的急性消化道传染病,其典型症状持续高热、相对缓脉、肝脾肿大、玫瑰疹与白细胞减少等为特征,肠出血、肠穿孔为主要并发症。该病近年来新发病例症状趋缓,主要以发热、畏寒、头痛为主。该病终年均可发病,但以夏秋季为多,可通过饮用水、食物、接触等途径进行传播。我国一般呈散在发生,可出现局部暴发或流行,是我国法定报告的乙类传染病之一[1]。郑州是河南伤寒副伤寒主要监测哨点地区之一,也是河南近十年来甲型副伤寒散发和暴发病例的最主要来源地。本研究对2013—2015年内分离自郑州的67株甲型副伤寒沙门菌进行PFGE分子特征分析与药敏测试,为深入了解甲型副伤寒沙门菌的分子流行病学特征与耐药状况,指导临床合理用药和肠道传染病的防控提供科学依据。

材料与方法  

1.样本来源:  于2013—2015年,从郑州发热伴出疹症候群监测系统2个哨点医院内,分离经病例血培养和粪便培养的67株甲型副伤寒沙门菌,其中2013年11株,2014年7株,2015年49株。

2.主要试剂与仪器:  沙门菌科玛嘉鉴定培养基购自法国CHROMAgar公司;沙门菌分型血清购自丹麦SSI公司;API20E肠杆菌科细菌鉴定板条购自法国bioMérieux公司;TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司;dNTP MIX购自上海生工;引物由上海invitrogen公司合成,HPLC纯化;琼脂糖购自西班牙Biowest公司;50×TAE/Tris-Hcl/EDTA/5×TBE购自北京Solarbio公司;SeakemGold琼脂糖购自美国LONZA公司;蛋白酶K购自英国Roche公司;限制性内切酶XbaⅠ购自大连宝生物公司;去离子水系统购于美国Milipore公司;SHZ-C型水浴摇床购于上海博迅仪器公司;三温水浴锅购于北京东方精瑞仪器公司;Minispin台式离心机、PCR仪购于德国Eppendorf公司;脉冲场凝胶电泳及凝胶成像系统系统购于美国Bio-Rad公司。

3.菌株的生化鉴定与血清分型:  从沙门菌科玛嘉平板上直接挑取淡紫色菌落转种脑心浸液平板,37 ℃培养16~18 h,0.85%生理盐水制备0.5麦氏浊度菌液,API20E肠杆菌科系统生化鉴定,沙门菌诊断血清进行O相玻片凝集分型,再利用0.4%营养软琼脂(参见WHO沙门菌鉴定手册[2])进行H相(1/2相)鞭毛诱导与血清凝集,生理盐水做自凝对照。根据K-W血清分型表确定对应血清型别[3]

4.药敏试验:  参照WHO推荐的Kirby-Bauer法[2],将甲型副伤寒沙门菌转种脑心浸液琼脂平板,37 ℃培养16 h后0.85%生理盐水制成0.5麦氏单位悬液。用无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于M-H平板表面,用分配器将药敏纸片压盖其上,15 min内送37 ℃温箱培养18 h以后测量各药敏纸片抑菌圈直径,参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2015年标准进行耐药表型判定,大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株[4]

5. PFGE分型:  按照国际PulseNet网络实验室公布的沙门菌脉冲场凝胶电泳标准分型方法,对67株甲型副伤寒沙门菌株进行分子分型,沙门菌标准株H9812作为分子量标记。限制性内切酶XbaⅠ(50 U),37 ℃酶切2 h。电泳参数:电压6 V/cm,脉冲时间2.2~63.8 s,线性转换,电场角度120°,电泳时间19 h,电泳液温度14 ℃。电泳结束后胶块用GelRed染料染色20 min后纯水清洗30 min后凝胶成像仪拍照(曝光时间3.0 s,去过饱和成像)[5]

6.数据分析:  采用BioNumerics 6.0软件对电泳图谱进行数据分析,绘制聚类分析树状图。聚类算法为非加权配对平均法,电泳条带位置优化度为1.5%,相似度100%认定为同一PFGE带型[6]

结果  

1.甲型副伤寒沙门菌对抗生素耐药情况:  67株甲型副伤寒沙门菌对氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、萘啶酸、环丙沙星、诺氟沙星、链霉素、庆大霉素、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶、甲氧嘧啶+磺胺甲唑、四环素等13种抗生素均有不同程度的耐药和多重耐药,相关耐药及多重耐药率详见表1表2。不同年份甲型副伤寒沙门菌对各药物耐药率详见图1

表1分离自郑州哨点医院的67株甲型副伤寒沙门菌对13种抗生素的耐药情况(株)
表2分离自郑州哨点医院的67株甲型副伤寒沙门菌耐药谱
图1不同年份分离自郑州哨点医院的67株甲型副伤寒沙门菌对13种抗生素的耐药率情况

2. PFGE分子分型结果:  67株甲型副伤寒沙门菌经XbaⅠ酶切后共分为10种带型,分别命名为PTYA1~PTYA10,各带型包含菌株数为1~48株,带型相似度在94.31%~100%。PTYA3包含48株菌,为其主要优势带型;PTYA1和PTYA9带型均包含7株菌,带型相似度与PTYA3较高(均在95%以上)。详见图2。67株甲型副伤寒沙门菌PFGE带型与耐药谱之间呈现一定的对应关系,PTYA1、PTYA3、PTYA9内均存在耐药表型一致的菌株聚集现象,其中PTYA1中4株菌耐药表型为(氨苄西林+庆大霉素+甲氧嘧啶+四环素+链霉素+萘啶酸+磺胺甲唑);PTYA3中7株菌耐药表型为(氨苄西林+甲氧嘧啶+环丙沙星+四环素+链霉素+萘啶酸+氯霉素+诺氟沙星+磺胺甲唑),6株菌耐药表型为(氨苄西林+庆大霉素+甲氧嘧啶+环丙沙星+四环素+萘啶酸+氯霉素+诺氟沙星+磺胺甲唑+链霉素);PTYA9中4株菌耐药表型为(氨苄西林+庆大霉素+甲氧嘧啶+四环素+萘啶酸+氯霉素+磺胺甲唑)。

图2分离自郑州哨点医院的67株甲型副伤寒沙门菌PFGE聚类分析图谱

讨论  副伤寒与伤寒一样,在河南历史上曾经是一种严重威胁人民群众健康的传染性疾患。建国初期由于百废待兴,卫生条件极差,伤寒副伤寒的发病呈直线上升趋势,二十世纪六七十年代发病率曾一度长期维持在150.00/10万例以上,最高达到236.3/10万例。副伤寒疫情波及河南158个县区,无论城市农村均有该病的发生和流行[1]。20世纪80年代后通过采取改水改厕,认真落实对传染源、传播途径和保护易感人群为主的综合性预防措施,河南副伤寒的暴发疫情迅速下降。20世纪90年代至今,副伤寒的发病率基本控制在0.32/10万~1.75/10万之间;目前河南副伤寒病例主要分布于郑州城区周边,流行趋势以高度散发为主,暴发疫情偶然发生在卫生条件差的特殊人群中。由于慢性带菌者的持续存在,传播途径不易彻底切断和人工免疫效果欠佳,输入性与聚集性病例仍时有出现。
        临床过度治疗与抗生素滥用是造成病原菌耐药问题日益突出的主要原因[7,8,9,10]。从本研究看,郑州自病例分离出的甲型副伤寒沙门菌耐药问题十分严重,其对试验所用抗生素均存在不同程度的耐药,比较严重的有青霉素类、磺胺类、四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类以及一代喹诺酮类,对临床常用三代喹诺酮类药物也存在较高的耐药率;其多重耐药情况也非常严重,临床分离菌株普遍对2~12种抗生素耐药,且对头孢类、喹诺酮类一线常用药及其他3类抗生素的耐药率呈逐年上升趋势,从临床和公共卫生角度看值得我们高度关注。另外,氨苄西林和四环素的耐药率呈下降趋势,推测其为临床用药量逐年减少和地位降低有关[11,12,13]。众所周知,目前细菌耐药在世界范围内都已成为临床和公共卫生领域高度关注的问题[14]。建立科学有效的病原菌耐药监测体系,及时分析分享数据,指导农业、畜牧业和医疗部门合理规范用药,减缓细菌耐药突变和扩散速度,降低临床治疗成本,是一件必要和迫切的事情[15,16,17]。本研究药敏试验方案采用了K-B法,虽然其具有操作简单、成本低廉等优点,但仅能够进行药敏表型的初筛,与现在普遍使用的MIC法相比不能够进行定性分析,所得数据无论是对于指导进一步的基因型研究还是临床精准用药都存在较大的局限性,这也是我们在今后的研究中需重点改进之处。
        本研究利用脉冲场电泳技术分析了郑州甲型副伤寒沙门菌全染色体"指纹图谱"特征,为基于该技术的病原体分子流行病学特征和暴发溯源积累了基线数据。值得关注的是甲型副伤寒沙门菌XbaⅠ带型的高聚集性与相似度;部分菌株的耐药表型与PFGE带型呈现聚类一致性,提示我们基于共同暴露源的菌株可能也具有相同的基因和耐药表型特征,这种特征尽管存在变异性和不确定性,但在一定范围内可以成为及早发现聚集性病例的重要指征参数[12]。同时我们也要认识到只有结合病原学和流行病学信息,才能更好地把握疾病传播特点和发挥PFGE技术在疾病防控、突发公卫事件/疫情处置中的作用。

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