中华预防医学杂志    2017年10期 483株肉鸡源大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ISCR1及int1基因的流行及耐药情况    PDF     文章点击量:138    
中华预防医学杂志2017年10期
中华医学会主办。
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陈霞 车洁 赵晓菲 张利锋 李娟
ChenXia,CheJie,ZhaoXiaofei,ZhangLifeng,LiJuan
483株肉鸡源大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ISCR1及int1基因的流行及耐药情况
Dissemination of insertion sequence common regions 1 and int1 gene and drug resistance of 483 Escherichia coli and Klebsiella pneumonia broiler isolates
中华预防医学杂志, 2017,51(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.10.004

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投稿日期: 2017-03-08
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483株肉鸡源大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ISCR1及int1基因的流行及耐药情况
陈霞 车洁 赵晓菲 张利锋 李娟     
陈霞 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
车洁 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
赵晓菲 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
张利锋 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
李娟 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要: 目的  研究山东肉鸡源细菌中ISCR1和int1基因的流行及耐药情况。方法  于2014年6月,在山东某大型肉鸡养殖场中选择日龄在37 d的待宰肉鸡作为采样对象。将鸡舍分为东部、南部、西部、北部、中部5区,选取不同区域肉鸡,采用单纯随机方法,按照1∶50比例进行泄殖腔拭子采样,共得到肉鸡粪便样本400份,经分离共得到483株非重复性样本菌株,其中大肠埃希菌373株(77.2%),肺炎克雷伯菌110株(22.8%);采用微量肉汤稀释法,测定菌株对8类10种抗菌药物的最低抑菌浓度;并对int1和ISCR1基因进行PCR扩增和测序;比较携带两种基因的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的耐药程度差异。结果  483株菌株中,共检测到携带int1基因的菌株为440株(91.1%),携带ISCR1基因的菌株为126株(26.1%),同时携带int1和ISCR1基因的菌株共有126株(26.1%)。37株同时不携带ISCR1和int1基因的大肠埃希菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为13.5%(5株)、78.4%(29株)和8.1%(3株),288株仅携带int1基因的大肠埃希菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为2.4%(7株)、74.7%(215株)和22.9%(6株),两者差异有统计学意义(P<0.001);26株仅携带int1基因的肺炎克雷伯菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为11.5%(3株)、76.9%(20株)和11.5%(3株),78株同时携带ISCR1和int1基因的肺炎克雷伯菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为0、35.9%(28株)和64.1%(50株),两者差异有统计学意义(P<0.001)。结论  int1和ISCR1基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的检出率较高,两类基因同时存在可介导更高程度的耐多药表型。
关键词 :大肠杆菌;克雷伯菌,肺炎;抗药;ISCR1;int1
Dissemination of insertion sequence common regions 1 and int1 gene and drug resistance of 483 Escherichia coli and Klebsiella pneumonia broiler isolates
ChenXia,CheJie,ZhaoXiaofei,ZhangLifeng,LiJuan     
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Li Juan, Email: lijuan@icdc.cn
Abstract:Objective  To investigate and analyze distribution characteristics of two multidrug resistance related genes in broiler isolates in Shandong province.Methods  The pre slaughter broilers were chosen from Shandong province in this study in June, 2014. A total of 400 fecal samples from five different zones (east, south, west, north and middle) of the hen house were collected. 373(77.2%) Escherichia coli and 110 (22.8%) Klebsiella pneumonia strains were isolated, and ISCR1 and int1 gene were detected by PCR assay and sequencing. The resistance to 10 drugs belonging to 8 classes antimicrobial drugs were obtained by using minimal broth dilution method and data analysis. The difference between isolates and drug resistance profiles was analyzed.Results  Among 483 isolates, 440 isolates (91.1%), 126 isolates (26.1%) and 126 isolates (26.1%) were detected as int1, ISCR1 and both two gene carriers, respectively. The rate of 37 E. coli isolates not carried ISCR1 or int1 gene resistant to 0 to 2, 3 to 5, 6 to 8 classes antimicrobial agents was 13.5% (n=5), 78.4% (n=29), and 8.1% (n=3), respectively; the rate of 288 only int1 gene E. coli carriers resistant to 0 to 2, 3 to 5, 6 to 8 groups antimicrobial agents was 2.4% (n=7), 74.7% (n=215), and 22.9% (n=6), respectively. The data above showed significant difference (P<0.001). The rate of 26 only int1 gene K. pneumonia carriers resistant to 0 to 2, 3 to 5, 6 to 8 classes antimicrobial agents was 11.5% (n=3), 76.9% (n=20), and 11.5% (n=3), respectively; the rate of 78 both two gene K. pneumonia carriers resistant to0 to 2, 3 to 5, 6 to 8 groups antimicrobial agents was 0, 35.9% (n=28), and 64.1% (n=50), respectively. The data above showed significant difference (P<0.001).Conclusion  Gene int1 and ISCR1 showed high prevalence in E. coli and K. pneumonia isolates. High level multi-drug resistance profile could be mediated by int1 and ISCR1 gene co-existence.
Key words :Escherichia coli;Klebsiella pneumonia;Drug resistance;ISCR1;int1
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抗菌药物的使用在临床和畜牧生产领域一直发挥着重要作用,随着近几十年来抗菌药物在各领域应用范围越来越广,造成了多耐药、泛耐药细菌不断扩散。有研究证实,ISCR及其上游相关序列与多种耐药基因的捕获和传播,与多药耐药表型的形成有密切关系[1,2],其中ISCR1是其中研究较为深入的亚型之一。肉鸡作为国内外主要的肉类消费来源之一,和人类日常生活关系密切[3]。研究显示,肉鸡携带的多药耐药细菌可借由污染胴体通过食物链传递给人群,造成耐药菌的传播[4,5],所以对肉鸡携带的耐药菌特别是多药耐药菌进行调查和分析十分必要。ISCR1和int1基因和细菌多种类耐药表型有密切联系,对其进行基因检测是一种预测和监测多药耐药菌的简便和可靠的方法。本研究对分离自山东省某大型肉鸡养殖场待屠宰肉鸡的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌进行int1基因和ISCR1基因的筛查,调查这两种与耐药基因有关的元件在肉鸡源大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌间的流行情况,并分析两种耐药元件与细菌多药耐药表型间的关系,深入研究动物源中多药耐药细菌向环境及人群散播风险,为控制食品动物源多药耐药细菌及多类耐药基因的快速传播提供理论基础。

材料与方法  

1.材料:  肉鸡源大肠埃希菌株和肺炎克雷伯菌株均分离自2014年6月山东某大型肉鸡养殖场,选择日龄在37 d的待宰肉鸡作为采样对象。当次待宰肉鸡约为2万羽,在同一栋鸡舍进行平养,养殖期间未出现病、死鸡现象。将鸡舍分为东部、南部、西部、北部、中部5区,选取不同区域肉鸡,采用单纯随机抽样方法,按照1∶50比例进行随机泄殖腔拭子采样,每一区域内采样肉鸡数量为80羽,共得到肉鸡粪便样本400份,经分离共得到483株非重复性样本菌株,其中大肠埃希菌为373株,占77.2%,肺炎克雷伯菌为110株,占22.8%。作为抗菌药物敏感性试验质控的大肠埃希菌ATCC 25922均为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存菌株。

2.试剂和仪器:  (1)试剂:脑心浸液琼脂培养基购于北京陆桥生物技术有限公司;Mueller-Hinton培养基购于英国Oxoid公司;药敏试验用抗菌药物标准品共8类,包括头孢唑林、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、氯霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、四环素、阿米卡星和他唑巴坦,均购于中国食品药品检定科学院;普通PCR扩增酶(Taq PCR MasterMix)购于天根生化科技(北京)有限公司;产物胶回收试剂盒(Qiaquick? Gel Extraction Kit)购于德国Qiagen公司;分离菌株DNA模板使用的细菌基因组DNA提取试剂盒购自百泰克生物技术有限公司。(2)仪器:磁珠法核酸自动提取仪购自百泰克生物技术有限公司;PCR仪LabCycler Standard Plus购自德国圣欧国际有限公司。

3.抗菌药物敏感性试验:  分离菌株药物敏感性试验结果判定采用美国临床与实验室标准协会推荐的微量肉汤稀释法,测定菌株对包括头孢唑林、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、氯霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、四环素、阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦在内的8类10种抗菌药物的最低抑菌浓度。每次试验用大肠埃希菌ATCC 25922作为质控。菌株药敏试验结果判定标准参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 2016年版判定标准[6]。耐受3类及以上抗菌药物的细菌判定为耐多药菌,耐受6类和7类抗菌药物的细菌判定为泛耐药菌,对8类抗菌药物耐药的判定为全耐药菌。

4. int1和ISCR1的PCR扩增与测序:  int1用引物int1-F(5'-CCTCCCGCACGATGAATC-3')和引物int1-R(5'-TCCACGCATCGTCAGGC-3')进行PCR扩增。扩增反应条件为:预变性94 ℃ 2 min,变性94 ℃30 s,退火57 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 15 s,30个循环,终延伸72 ℃ 5 min,预期阳性片段为280 bp。ISCR1基因用引物ISCR1-F(5'-ATGTCGCTGGCAAGGAACGC-3')和ISCR1-R(5'-AGACGACTCTGTGATGGATC-3')进行PCR扩增。扩增反应条件为:预变性94 ℃ 2 min,变性94 ℃ 30 s,退火56.5 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min,30个循环,终延伸72 ℃ 5 min,预期阳性片段为1.45×103 bp[7]。获得的部分阳性产物经胶回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司进行测序,并和GenBank数据库进行blast比对。

5.统计学分析:  采用SPSS 19.0软件进行数据整理和统计分析。采用趋势χ2检验分别分析携带不同耐药基因的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的多药耐药表型的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1. int1基因检出情况:  共检测到携带int1基因菌株为440株,携带率为91.1%。其中携带int1基因的大肠埃希菌336株,肺炎克雷伯菌104株,分别占大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离总数的90.1%和94.5%。详见表1

表1483株肉鸡源分离菌株ISCR1及int1基因检出情况

2. ISCR1基因检出情况:  共检测到携带ISCR1基因的菌株为126株,携带率为26.1%。其中大肠埃希菌48株,肺炎克雷伯菌78株,分别占大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离总株数的12.9%和70.9%。详见表1

3. int1和ISCR1基因共同检出情况:  同时携带int1和ISCR1基因的菌株共有126株,携带率为26.09%。其中大肠埃希菌为48株,肺炎克雷伯菌为78株。与单独携带ISCR1基因的分离细菌完全一致。详见表1

4.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药情况:  483株菌株中,耐多药菌株为466株,占所有受试菌株的96.5%;耐多药大肠埃希菌为361株,耐多药肺炎克雷伯菌为105株。当大肠埃希菌同时不携带ISCR1和int1基因时,耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为13.5%、78.4%和8.1%;单独携带int1基因时,耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为2.4%、74.7%和22.9%,差异有统计学意义;当肺炎克雷伯菌菌株单独携带int1基因时,耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为11.5%、76.9%和11.5%;同时携带ISCR1和int1基因时,耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为0、35.9%和64.1%,差异有统计学意义。详见表2

表2不同ISCR1基因和int1基因携带情况的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药情况(n=483)

讨论  int1和ISCR1基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中分布流行,整合子被认为是与细菌多种类耐药基因水平传播相关的关键因素之一,可介导细菌间多种类耐药基因传播,使多药耐药性得以广泛散播[8],通过检测Ⅰ型整合酶编码基因int1可以初步判断细菌是否携带Ⅰ型整合子及耐药基因盒[9]。ISCR1基因构成的复合型Ⅰ型整合子近年来成为介导多药耐药性散播的重要因子[10,11,12,13]。目前对于ISCR1基因调查研究的文章多囿于临床菌株,在我国畜牧养殖动物中该类调查尚在少数[11]。本研究结果显示同来源的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中,后者的ISCR1基因检出率远远高于前者,这和陈霞等[7]于2013年报道的临床来源菌株研究结果一致,提示ISCR1基因在两种常见细菌中分布的差异可能由两种细菌中存在不同类型的质粒和转座系统造成。
        既往研究证实,int1和ISCR1基因均和多种类耐药基因的传播有关[1, 7, 10,11,12,13]。两种基因的存在和细菌的多药耐药表型相关,对其进行监测是监控多药耐药细菌发生和传播的关键手段。int1基因经常出现在ISCR1基因的上游,与其构成复合型Ⅰ型整合子,本研究结果未发现菌株中单独存在ISCR1,可以推测受试菌株上游均存在int1基因,这与以往的研究结论相似[1, 14]。本研究结果发现同时携带两种基因元件的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌均为多药耐药菌,且各有37.5%和64.1%为泛耐药菌或全耐药菌,由此可推断两类基因同时存在可介导更高程度的多药耐药表型。
        肉鸡作为一种人类消费食用的普通食物来源之一,其携带的多药耐药菌可通过食物链传递到人,给人群日益严重的耐药菌防控造成影响[5,15,16]。本研究结果提示,需加强在我国动物源菌株中int1以及ISCR1元件的监测工作,以更好地了解我国动物源细菌中多药耐药流行情况,为防控和分析包括人、动物、环境在内的多领域多种类耐药基因流行特点提供更为简便的方法和技术手段。

参考文献
[1]TolemanMA, BennettPM, WalshTR. ISCR elements: novel gene-capturing systems of the 21st century?[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2006,70(2):296-316. DOI: 10.1128/MMBR.00048-05.
[2]TolemanMA, WalshTR. ISCR elements are key players in IncA/C plasmid evolution[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010,54(8):3534. DOI: 10.1128/AAC.00383-10.
[3]王燕明,辛翔飞,王济民. 2015年全球肉鸡生产、贸易及产业经济政策研究[J].中国家禽, 2016, 38(6): 1-5.
[4]NhungNT, CuongNV, ThwaitesG, et al. Antimicrobial Usage and Antimicrobial Resistance in Animal Production in Southeast Asia: A Review[J]. Antibiotics (Basel), 2016,5(4):37.DOI: 10.3390/antibiotics5040037.
[5]朱冬梅,彭珍,刘书亮,等.肉鸡屠宰加工过程中沙门氏菌的污染情况及其耐药性分析[J].食品科学,2014,35(17):214-219. DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201417041.
[6]Clinical and Laboratory Standards Institiute. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 27th Edition[EB/OL].[2017-01-03].https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100.
[7]陈霞,袁敏,李桂喜,等.基因捕获元件int1和ISCR1在临床菌株中的分布及与细菌耐药性的关系研究[J].中国人兽共患病学报,2013,29(7):646-652. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2013.07.002.
[8]LuL, DaiL, WangY, et al. Characterization of antimicrobial resistance and integrons among Escherichia coli isolated from animal farms in Eastern China[J]. Acta Trop, 2010,113(1):20-25. DOI: 10.1016/j.actatropica.2009.08.028.
[9]ChenX, LiGX, ZhangH, et al. Characterization of class 1 integron gene cassettes among clinical bacteria isolated from one large hospital in northern China[J]. Biomed Environ Sci, 2013,26(12):1003-1007. DOI: 10.3967/bes2013.038.
[10]CasellaT, RodríguezMM, TakahashiJT, et al. Detection of blaCTX-M-type genes in complex class 1 integrons carried by Enterobacteriaceae isolated from retail chicken meat in Brazil[J]. Int J Food Microbiol, 2015,197:88-91. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.12.001.
[11]LiJ, LanR, XiongY, et al. Sequential isolation in a patient of Raoultella planticola and Escherichia coli bearing a novel ISCR1 element carrying blaNDM-1[J]. PLoS One, 2014,9(3):e89893. DOI: 10.1371/journal.pone.0089893.
[12]WangF, WuK, SunJ, et al. Novel ISCR1-linked resistance genes found in multidrug-resistant Gram-negative bacteria in southern China[J]. Int J Antimicrob Agents, 2012,40(5):404-408. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2012.06.016.
[13]陈霞,李桂喜,禹惠兰,等.插入序列共同区在多种临床菌株间的分布及其与超广谱β-内酰胺酶基因blaPER-1的关系研究[J].疾病监测,2013,28(3):178-183.
[14]杨晓亮,杨波.鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子和ISCR1的检测及其结构分析[J].中国病原生物学杂志,2014,9(9):779-782+787.
[15]朱丹丹,遇晓杰,郑晓华,等.黑龙江省肉鸡养殖和生产加工环节中沙门菌耐药性分析[J].中华预防医学杂志,2016,50(9):833-835. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.09.018.
[16]邵纯纯,胡彬,毕振旺,等.山东省微山县动物粪便中产志贺毒素大肠埃希菌血清型鉴定及耐药性分析[J].中华预防医学杂志,2017,51(1):70-75. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.01.014.