中华预防医学杂志    2017年10期 携带新型金属β-内酰胺酶基因菌株在某患者体内播散及耐药研究    PDF     文章点击量:126    
中华预防医学杂志2017年10期
中华医学会主办。
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赵晓菲 袁敏 陈霞 刘新凤 于德山 李娟
ZhaoXiaofei,YuanMin,ChenXia,LiuXinfeng,YuDeshan,LiJuan
携带新型金属β-内酰胺酶基因菌株在某患者体内播散及耐药研究
Drug resistance and dissemination of New Delhi metallo-β-lactamase 1 positive bacteria in a patient
中华预防医学杂志, 2017,51(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.10.005

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投稿日期: 2017-03-31
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携带新型金属β-内酰胺酶基因菌株在某患者体内播散及耐药研究
赵晓菲 袁敏 陈霞 刘新凤 于德山 李娟     
赵晓菲 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
袁敏 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
陈霞 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
刘新凤 甘肃省疾病预防控制中心传染病预防控制所
于德山 甘肃省疾病预防控制中心传染病预防控制所
李娟 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要: 目的  分析携带新型金属β-内酰胺酶(NDM-1)基因(blaNDM-1)菌株在患者不同部位间的播散情况和对环境的影响。方法  于2010年,在某51岁男性患者因车祸入院时及整个治疗过程中,采集患者的血液、尿液、痰液、粪便样本,同时对患者病房环境进行取样,按照临床微生物检验的常规操作进行碳青霉烯耐药菌株筛查和分离;利用VITEK微生物鉴定/药物敏感性分析仪和E-test试剂条对分离的耐药菌株进行种属鉴定和药物敏感性检测,利用PCR、PFGE及Sourthern杂交对菌株blaNDM-1进行检测及定位。结果  患者从10月1日入院到11月4日出院,在其血液、痰液、尿液、粪便及病房地面共分离到的9株菌株,血液样本分离到产酸克雷伯菌、植生拉乌尔菌和鲍曼不动杆菌,痰液样本中分离到肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌,尿液样本中分离到洛菲不动杆菌,粪便样本中分离到大肠杆菌,病房地面样本中分离到洛菲不动杆菌和不动杆菌属菌株,其中4株菌为blaNDM-1菌株,分别为从患者血液样本中分离的植生拉乌尔菌(RpNDM1),从患者粪便样本中分离到的大肠杆菌(EcNDM1),从病房地面分离的洛菲不动杆菌(AlDNM1)和不动杆菌属菌株(AsNDM1);4株菌株均对哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、厄他培南耐药,且携带的blaNDM-1均位于质粒上。结论  blaNDM-1可以在短期内实现跨种属传播,在院内感染控制中应考虑blaNDM-1菌株在不同部位间传播的风险,加强对携带该菌株患者的粪便样本的处理。
关键词 :抗药性;β内酰胺酶类;感染控制
Drug resistance and dissemination of New Delhi metallo-β-lactamase 1 positive bacteria in a patient
ZhaoXiaofei,YuanMin,ChenXia,LiuXinfeng,YuDeshan,LiJuan     
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention; State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control, Beijing 102206, China
Corresponding author: Li Juan, Email: lijuan@icdc.cn
Abstract:Objective  The aim of this work was to report the surveillance and dissemination of NDM-1 positive bacteria in a patient and ward environment.Methods  In 2010, during the therapy for a 51 years old patient, clinical and environmental samples were collected for carbapenem resistant bacterial culture, according to the clinical microbiological examination. Strains identification and antibiotic susceptibility were tested by VITEK Compact 2 system and E-test. The blaNDM-1 was detected by PCR and analyzed by sequencing. Plasmids containing blaNDM-1 were submitted to PFGE-S1 and Southern hybridization.Results  During hospitalization from October 1st to November 4th, nine strains were isolated from blood, sputum, urine, fecal, and ward ground samples. The Klebsiella oxytoca, Raoultella planticola, and Acinetobacter baumannii were isolated from blood sample. The Klebsiella pneumonia and Acinetobacter baumannii were isolated from sputum sample. An Acinetobacter lwoffii was isolated from urine sample. An Escherichia coli was isolated from fecal sample. And the Acinetobacter lwoffii and Acinetobacter spp. were isolated from ward ground. Four strains were NDM-1 positive, which were Raoultella planticola (RpNDM1) isolated from blood, Escherichia coli (EcNDM1) isolated from fecal, Acinetobacter lwoffii (AlDNM1) and Acinetobacter spp. (AsNDM1) isolated from ward ground. Four NDM-1 positive strains were resistant to Piperacillin, Piperacillin tazobactam, Cefepime, Ceftriaxone, Ceftazidime, Imipenem, Meropenem, and Ertapenem. Southern hybridization revealed that blaNDM-1 were all located on plasmids in the four positive strains.Conclusion  blaNDM-1 can transfer rapidly among different species, resulting in difficult to control and prevent. While isolating patient who is carrying NDM-1 positive strains, more attention should be paid to the disposal of patient's excreta, especially stool, should be paid more attention.
Key words :Drug resistance;Beta-lactamases;Infection control
全文

2009年,英国卡迪夫大学Timothy R. Walsh教授研究团队在肺炎克雷伯菌中首次发现了一种新型金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase 1,NDM-1),该酶可以水解除氨曲南以外的所有β-内酰胺类药物,介导菌株对青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素的耐受。随后,更多的研究学者逐渐发现不仅在肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、弗氏枸橼酸杆菌等肠杆菌科细菌中存在NDM-1耐药基因(blaNDM-1[1,2,3],鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌也携该基因[4,5,6,7,8]。不仅如此,到目前为止已发现包括blaNDM-1在内的18种NDM基因亚型[1,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]blaNDM菌株被称为"NDM超级耐药菌",因此它不是某一种细菌,而是指一类细菌,任何一种细菌在获得blaNDM、表达金属β-内酰胺酶后,都可以称为"NDM超级耐药菌"。
        由于目前针对NDM超级耐药菌的抗感染治疗药物非常有限,NDM等碳青霉烯耐药菌株感染引起的病死率很高。据美国疾病预防控制中心官方网站发布的消息,碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染的病死率约40%~50%[23]。因此提高对包括NDM-1在内的碳青霉烯酶携带菌株的检测能力,加强感染者或定植者的隔离防护,减少碳青霉烯耐药菌的传播和感染,对预防和控制院内感染具有重要意义。
        本研究通过对1例blaNDM-1菌株感染患者进行了各类临床样本中blaNDM-1菌株的目标监测,分析NDM-1耐药菌株在患者不同部位间的播散及对环境的影响,希望为NDM-1耐药菌株院内感染的有效防控提供依据。

材料与方法  

一、样本来源  患者,男,51岁,农民,既往无特殊病史,无出国史。2010年10月1日因车祸入院,初步诊断为颅脑损伤、脑出血、肋骨骨折,行颅脑减压术。术后给予氨苄西林/舒巴坦钠,头孢唑肟预防感染,根据血液样本分离的耐药菌株的药物敏感谱,给予阿米卡星联合哌拉西林/他唑巴坦替换亚胺培南进行抗感染治疗。随后先后使用头孢哌酮/舒巴坦纳、亚胺培南、莫西沙星、米诺环素、利奈唑胺和氟康唑进行抗感染治疗[3]。在患者治疗过程中,主管护士遵医嘱按照临床检验样品采集方案采集患者的血液、痰液、尿液、粪便标本进行微生物学检验,同时院内感染科相关工作人员按照院内感染监测流程定期对病房环境进行采样[24]。采集的样本4 h内送至临床微生物实验室进行常规微生物学检验,并同时进行碳青霉烯耐药菌株的目标筛查[25]

二、试剂和仪器  

1.试剂:  脑心浸液琼脂培养基购于英国Oxoid公司;抗生素购于美国Sigma公司;琼脂糖购于西班牙Biowest公司;Goldview购于北京艾德莱生物科技有限公司;Tris-HCl缓冲液、EDTA、5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液、溴化乙锭(EB)染液购于北京索莱宝科技有限公司;PCR mix购于日本Takara公司;E-test试剂条购于法国生物梅里埃公司;胶回收试剂盒购于德国QIAGEN公司;ECL核酸杂交试剂盒购于德国GE公司;限制性内切酶S1酶购于英国New England Biolab公司;PFGE琼脂糖(Seakem Gold Agarose)购于瑞士Lonza公司。

2.仪器:  紫外凝胶成像系统(美国UVB公司);琼脂糖凝胶电泳仪(德国GE公司);VITEK Compact 2(法国BioMerieux公司);真空转膜仪(美国Bio-Rad公司);脉冲场凝胶电泳仪CHEF DR II(美国Bio-Rad公司)。

三、方法  

1.菌株的分离培养:  各类样本的菌株分离培养及鉴定按照临床微生物检验的常规操作进行。碳青霉烯耐药菌株的目标筛查按照如下步骤进行:对收集的尿液样本离心处理后,取沉渣涂布于含有0.5 μg/ml亚胺培南的脑心浸液琼脂培养基,37 ℃过夜培养;唾液、粪便样本直接涂布含有0.5 μg/ml亚胺培南的脑心琼脂培养基,37 ℃过夜培养。

2. blaNDM-1的PCR扩增及分析:  挑取含有0.5 μg/ml亚胺培南抗性培养平板上的少量菌落混悬于100 μl无菌Tris-EDTA缓冲液中,95 ℃水浴10 min,离心后取3 μl上清液为模板,进行blaNDM-1的PCR扩增。PCR引物及扩增参数见表1。PCR产物用1%琼脂糖凝胶(含0.1% Goldview)电泳分离,在紫外凝胶成像系统(265 nm波长)中观察结果。用胶回收试剂盒回收阳性PCR产物,送华大基因测序服务部测序。将测序结果与NCBI GeneBank中提供的参考序列进行比对,以明确其基因亚型。

表1NDM-1及16 S rDNA基因扩增引物序列、产物长度及退火温度

3.菌株的鉴定及药物敏感性检测:  挑取blaNDM-1的菌落进行扩大培养,取纯培养物制备成麦氏0.5的菌液,用VITEK Compact 2微生物鉴定/药物敏感性分析仪鉴定细菌的种属。同时,进行16 S rDNA序列PCR扩增,PCR引物及扩增参数见表1。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收后送华大基因测序服务部测序。测序结果与NCBI数据库比对,确定细菌的种属。为了明确blaNDM-1菌株的耐药谱,取细菌纯培养物经VITEK Compact 2微生物鉴定/药物敏感性分析仪检测药物敏感性,用E-test试剂条测定NDM-1阳性菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC)。

4. PFGE及blaNDM-1的Southern杂交:  PFGE因其可以区分较大的DNA片段而广泛应用于菌株质粒图谱的构建和基因的质粒定位中[26,27]。PFGE限制性内切酶谱图用仪器CHEF DR II获得。在25 ℃水浴环境下,用S1酶酶切胶块20 min;在14 ℃的0.5×TBE电泳缓冲液中,脉冲场1~20 s,200 V电压,电泳10 h;电泳后的凝胶用1 μg/ml EB染色,双蒸水脱色后成像保存。然后通过真空转印的方法将核酸片段转移到尼龙膜上,用ECL核酸杂交试剂盒标记blaNDM-1探针,与尼龙膜上的DNA片段进行42 ℃杂交。对胶片显影、定影后记录blaNDM-1杂交结果。

结果  

一、菌株的分离培养及鉴定  患者从10月1日入院到11月4日出院,在其血液、痰液、尿液、粪便及病房地面共分离到的9株相关菌株:10月4日,从患者血液样本分离到产酸克雷伯菌,从痰液样本中分离到肺炎克雷伯菌;10月9日,从患者血液样本中分离到植生拉乌尔菌;10月15日,从患者痰液中分离到鲍曼不动杆菌,从尿液样本中分离到洛菲不动杆菌;10月22日,从患者血液样本中分离到鲍曼不动杆菌;10月29日,从患者粪便样本中分离到大肠杆菌,病房地面样本中分离到洛菲不动杆菌和不动杆菌属菌株。详见图1。除1株分离自病房地面样本的菌株只能鉴定到不动杆菌属外,其他菌株均能经VITEK Compact 2微生物鉴定仪准确鉴定到种。进一步,通过对病房地面分离到这株菌的16S rDNA序列的测序和比对,发现其与Acinetobacter towneri同源性最高(96.7%),考虑其可能是不动杆菌属下的新种,暂命名为Acinetobacter spp。

图1从感染携带新型金属β-内酰胺酶基因菌株患者入院到出院全程菌株分离和抗菌药物使用情况

二、blaNDM-1基因的扩增及检测  9株菌株中有4株blaNDM-1菌,分别是10月9日从患者血液样本中分离的植生拉乌尔菌(命名为RpNDM1),10月29日从患者粪便样本中分离到的大肠杆菌(命名为EcNDM1),10月29日从病房地面分离的洛菲不动杆菌(命名为AlDNM1)和不动杆菌属菌株(命名为AsNDM1)。

三、blaNDM-1菌株的药物敏感性检测  4株NDM-1阳性菌株均对黏菌素、替加环素、阿米卡星敏感,其中对黏菌素的MIC值≤0.75 μg/ml;对替加环素MIC值≤0.75 μg/ml,对阿米卡星MIC值≤6 μg/ml。4株NDM-1阳性菌株均对哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、厄他培南耐药,其中对哌拉西林MIC值≥32 μg/ml,对哌拉西林-他唑巴坦MIC值≥32 μg/ml,对头孢噻肟MIC值>256 μg/ml,对亚胺培南MIC值>32 μg/ml,对美罗培南MIC值≥12 μg/ml,对厄他培南MIC值≥12 μg/ml。详见表2表3

表2分离自不同样本的9株菌株耐药情况
表3分离自不同样本的4株携带新型金属β-内酰胺酶基因菌株的抗菌药物最小抑菌浓度(μg/ml)

四、PFGE-S1质粒图谱及blaNDM-1基因探针杂交  4株blaNDM-1菌株均携带质粒,每株菌中质粒的数量为1~6个。在植生拉乌尔菌株RpNDM1中,blaNDM-1位于大小约280 kb的质粒上;在大肠杆菌EcNDM1中,blaNDM-1位于大小约58 kb的质粒上;在洛菲不动杆菌AlNDM1和不动杆菌AsNDM1中,blaNDM-1均位于大小约33 kb的质粒上。

讨论  自2009年NDM-1在印度首次被发现,NDM-1在全球迅速播散,目前已经在全球五大洲的大部分国家或地区被发现[28]。其宿主菌也从最初的肺炎克雷伯菌扩展到大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗氏枸椽酸杆菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等大部分革兰阴性菌和肠球菌等革兰阳性菌[29,30],其播散范围之广和传播速度之快令所有的研究者震惊并一度引起了全球恐慌[30]。推测含有blaNDM-1的质粒具有广泛的宿主,能在不同的菌株之间穿梭传递,并且blaNDM-1还可以在不同质粒间移动、重组,从而实现快速传播[31,32]
        本研究结果发现,blaNDM-1菌株首先在患者血液样本中被分离,应用敏感药物阿米卡星后,血液样本中再未分离出blaNDM-1菌株。但20 d后,blaNDM-1大肠杆菌在患者粪便样本中被分离,同时病房地面样本中也分离到两种blaNDM-1不动杆菌。虽然无法确定4株blaNDM-1菌株间的传播关系,但考虑到2010年,blaNDM-1菌株刚刚在全球播散,我国也仅有少数报道,4株不同种属blaNDM-1菌株同时和1例患者相关,因此认为它们可能不是孤立存在的。推测可能的传播途径是阿米卡星的使用抑制和杀灭了患者体内的植生拉乌尔菌RpNDM-1,但blaNDM-1却并没有完全消失,其可能转移到耐受阿米卡星的菌株中,随后又转移到胃肠道的大肠杆菌中形成了blaNDM-1 EcNDM1。应用亚胺培南后,亚胺培南的选择压力使胃肠道内blaNDM-1菌株EcNDM1优势生长,从而能够从粪便样本中分离得到。病房地面的blaNDM-1不动杆菌菌株可能是由于粪便的污染造成了blaNDM-1的传播。当然,另一种可能的传播途径是医院环境中blaNDM-1不动杆菌将blaNDM-1转移到了植生拉乌尔菌中,形成了RpNDM-1菌株,造成了患者的血液感染,随后blaNDM-1又转移到了患者肠道内的大肠杆菌EcNDM1中。由于缺乏blaNDM-1菌株检出前对环境样本的监测结果,因此还不能确定4株菌株间的传播过程。但无论是哪种传播途径,blaNDM-1短期快速的跨种属播散能力给院内感染监控敲响了警钟。
        虽然上述4株blaNDM-1菌株中blaNDM-1均由质粒携带,但blaNDM-1的质粒大小并不尽相同,两株地面环境来源的不动杆菌携带相似大小的质粒,可能为相同的质粒,提示可能是质粒的接合转移介导了blaNDM-1的传播。在植生拉乌尔菌RpNDM-1和大肠杆菌EcNDM-1中,blaNDM-1分别定位于两个大小迥异的质粒,提示除了质粒,还有其他的可移动元件参与了blaNDM-1的传播。
        blaNDM-1所具有的快速播散能力使NDM-1超耐药菌的院内感染防控面临严峻挑战。针对NDM-1超耐药菌的监测需要同时考虑菌株的传播和blaNDM-1的传播。对于携带NDM-1超耐药菌的患者,除常规隔离防护外,还应加强对患者各种排泄物尤其是粪便的处理,有助于延缓NDM-1超耐药菌的产生和blaNDM-1的传播,降低NDM-1耐药菌株在医院流行的风险。

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