中华预防医学杂志    2017年10期 北京某医院耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌分子流行病学研究    PDF     文章点击量:157    
中华预防医学杂志2017年10期
中华医学会主办。
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陈东科 周海健
ChenDongke,ZhouHaijian
北京某医院耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌分子流行病学研究
Molecular epidemiology of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae in a hospital in Beijing
中华预防医学杂志, 2017,51(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.10.006

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投稿日期: 2017-03-23
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北京某医院耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌分子流行病学研究
陈东科 周海健     
陈东科 100730 北京医院检验科
周海健 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要: 目的  分析北京某医院分离的耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌(CRKP)的分子流行病学特征。方法  实验菌株来源于2010年5月至2015年10月在北京某三甲医院分离的所有对碳青霉烯类抗生素呈现耐药性的肺炎克雷伯菌。同一患者剔除相同部位的重复分离菌株后,一共375株被纳入本研究。采用PFGE对CRKP进行分型,并挑选不同PFGE型别的代表菌株开展多位点序列分型(MLST)、常见碳青霉烯类抗生素耐药基因(blaKPCblaNDMblaIMPblaVIMblaOXA-48)检测和全基因组测序分析;挑选1株CRKP(A1502)进行基于全基因组的分型,分析该菌株和其他医院和其他地区分离株之间的遗传进化关系。结果  375株CRKP分为140个PFGE型别,其中5个型别包含的菌株数大于5株,为优势型别,分别为KPX01.CN0058(128株)、KPX01.CN0014(36株)、KPX01.CN0268(16株)、KPX01.CN0265(12株)和KPX01.CN0438(7株)。不同的优势PFGE型别分布在不同的时间段和病区。MLST分型结果显示,15株代表菌株中有13株为ST11型KPC-2菌株。在全基因组分型聚类树中,A1502与分离自北京其他医院的菌株聚集成簇,而与分离自上海、杭州的菌株聚类关系较远。结论  该医院CRKP分离株存在优势基因型别,流行的克隆群为携带KPC-2基因的ST11型;该克隆群存在医院内和医院间的传播扩散。
关键词 :克雷伯菌,肺炎;抗药性;分子分型;碳青霉烯类抗生素;基因组分型
Molecular epidemiology of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae in a hospital in Beijing
ChenDongke,ZhouHaijian     
Department of Clinical Laboratory, Beijing Hospital, Beijing 100730, China
Corresponding author: Zhou Haijian, Email: zhouhaijian@icdc.cn
Abstract:Objective  To reveal the molecular epidemiological characteristics of Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) isolated from a three level teaching hospital in Beijing.Methods  Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was carried out to subtyping 375 CRKP isolated in that hospital between May 2010 and October 2015. Fifteen strains were chose based on the PFGE patterns to be analyzed by multi-locus sequence typing (MLST) and detection of carbapenem-resistance genes. One strain (A1502) was selected for whole genome sequencing and analyzing.Results  The 375 CRKP were divided into 140 PFGE types, among which five types contained more than five strains. The dominant types were distributed in different time periods and wards. Among the 15 strains tested by MLST and carbapenem-resistance genes detection, 13 were ST11 strains carrying KPC-2 gene. By genome-based typing, A1502 was clustered together with strains from other hospitals of Beijing but far from the strains from Shanghai and Hangzhou.Conclusion  The CRKP epidemic clone (ST11 clone carrying KPC-2) has been spreading within single hospital and across different hospitals in Beijing.
Key words :Klebsiella pneumoniae;Drug resistance;Molecular typing;Carbapenem antibiotics;Genome-based typing
全文

耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)是临床常见的耐药菌之一,常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延,同时会引起院内感染和暴发而导致严重的公共卫生问题[1,2]。2017年2月27日,WHO发布了迫切需要新型抗生素的细菌清单,根据对新型抗生素的迫切需求程度将12种耐药形势严峻的细菌分为3个类别:极为重要、十分重要和中等重要,其中耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌位于1类重点的极为重要清单中[3]。在对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌中,CRKP占有非常大的比例,而且我国临床分离肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率在过去10年间呈较大幅度增加[4,5]。自从2001年在美国报道了第1例携带KPC-2型耐药基因的CRKP以来[6],世界各地不断有CRKP的报道[7]。在中国,报道的首例CRKP发现于2007年[8],随后在全国各地均有报道[9,10]
        国内众多学者对我国临床分离多重耐药肺炎克雷伯菌包括CRKP进行了研究,主要集中在耐药表型、耐药基因型别等方面[10,11,12,13],目前缺少对同一家医院多年分离的CRKP菌株开展分子分型结合分离时间和病区进行分析的研究。本研究对北京某三甲教学医院2010—2015年分离的375株CRKP菌株进行PFGE分型,调查该院菌株的分子流行病学特征。随后挑选代表菌株开展多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)和全基因组序列分析,以期揭示该医院流行菌株与国内外流行菌株的遗传进化关系。

菌株与方法  

1.菌株来源:  本研究实验菌株来源于2010年5月至2015年10月在北京某三甲教学医院分离的所有对碳青霉烯类抗生素呈现耐药性的肺炎克雷伯菌。同一患者剔除相同部位的重复分离菌株后,一共375株被纳入本研究。

2.抗菌药物敏感性检测:  根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的抗菌药物敏感性试验执行标准,采用VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪(法国BioMérieux公司)或者纸片法(K-B法)对3种碳青霉烯类抗生素(厄他培南、亚胺培南、美罗培南)进行实验及结果判读。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922,购自美国模式菌种收集中心。

3. PFGE实验和分析:  肺炎克雷伯菌PFGE分型方法使用本课题组在前期研究中建立的方法[14,15],关键参数如下:调整细菌悬液浓度,使浊度为3.8~4.0;使用45 U XbaⅠ(TAKARA公司,中国大连)进行酶切;在CHEF-DRⅢ(Bio-Rad Laboratories公司,美国)电泳仪中进行脉冲场电泳;电泳参数为6~36 s,18.5 h。PFGE图像录入BioNumerics(Version 5.10,Applied maths公司,比利时)软件包进行处理,识别图像条带,经统一的分子质量标准进行校准,标定条带位置,必要时进行手工校正,<2.05×104 bp的条带忽略不计。每两个图像之间的相似性系数用Dice系数(Dice coefficients,SD)表示[16]。SD值反映不同菌株PFGE图像之间的相似性程度,范围在0~1之间,0代表完全不一样,1代表完全相同。出现不同条带即判定为不同的型别,对每一个型别都进行命名。根据每两个图像之间的相似性系数,用非加权配对算术平均法(unweighted pair group average method,UPGMA)进行聚类,构建聚类树。

4.耐药基因检测:  根据PFGE图谱和聚类图挑选带型不同的代表菌株开展常见碳青霉烯类抗生素耐药基因(blaKPCblaNDMblaIMPblaVIMblaOXA-48)检测和测序分析。如果检出碳青霉烯类抗生素耐药基因阳性,对扩增片段进行序列测定,将序列提交美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库,通过基本局部匹配查询工具(basic local alignment search tool,BLAS)比对,确定耐药基因型别。

5. MLST实验和分析:  根据PFGE图谱和聚类图挑选带型不同的代表菌株开展MLST实验,参考法国巴斯德研究所MLST网站(http://bigsdb.pasteur.fr/)公布的肺炎克雷伯菌MLST方法。对7个管家基因rpoB、gapA、mdhpgiphoE、infB和tonB的片段进行PCR扩增和序列测定,测序结果与上述网站的数据库进行比对获得各基因位点的编号和MLST型别。

6.全基因组测序和分析:  在最早出现的优势PFGE带型菌株中随机挑选1株(A1502)开展全基因组测序和分析。全基因组序列通过构建500 bp片段库,使用hiseq 2500(Illumina公司,美国)测序仪测定。使用SOAPdenovo v 2.04软件进行数据组装[17]。将单拷贝的核心基因利用muscle对齐后,用TreeBeST软件使用邻近法构建聚类树。将本研究中新测序菌株的基因组数据和其余7株已公布的中国分离的ST11型肺炎克雷伯菌(HS11286、JM45、TR249、A1732、A1760、A1763、A1771)和1株ST11型国际标准菌株(ATCC BAA-2146)基因组进行全基因组分析。由于目前还没有文献报道确定细菌基因组分析中,使用哪种方法构建的聚类树更能反映实际情况,本研究使用3种方法构建聚类树,分别从直系同源基因、全基因组MLST、全基因组单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)3个方面构建聚类树。(1)通过不同菌株之间的基因组比对确定SNP。潜在的SNP位点同过使用MUMMer软件(参数设置为-pileup_q 20)进行全局比对进行筛选。上下游各100 bp均比对上的SNP位点被保留。去除在重复序列区的SNP。用TreeBeST软件使用邻近法将SNP数据构建进化树。(2)通过不同菌株之间的基因组比对,将单拷贝的核心基因对齐后,用TreeBeST软件使用邻近法构建进化树。核心基因组位点序列分型(core genome multilocus sequence typing,cgMLST)中的基因位点的筛选参考文献[18]中的方法,使用perl svg程序绘制进化树,用样本之间差异基因的数目作为距离数据。(3)将组装序列比对到NCBI的质粒库中进行查找,达到75%以上覆盖度、90%序列相似度的判定为存在该质粒。耐药基因注释和搜索是将序列比对至耐药基因数据库(Antibiotic Resistance Genes Database,ARGD)中,查找耐药性相关基因的名称,所耐受的抗生素种类等信息。

结果  

1.菌株基本情况:  实验菌株年份分布和标本来源分布见表1。375株对碳青霉烯类抗生素呈现耐药性的肺炎克雷伯菌分离时间为2010年5月至2015年10月,标本来源主要为痰、尿、血、导管、腹水等。

表1375株耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌的分离时间和标本来源分布(株)

2. PFGE分型及型别的时间和病区分布情况:  (1)PFGE分型:375株CRK共分为140个PFGE型别,每个型别分别包含1~128株菌(图1)。其中有5个型别包含的菌株数大于5株,为优势型别,分别是KPX01.CN0058(128株)、KPX01.CN0014(36株)、KPX01.CN0268(16株)、KPX01.CN0265(12株)、KPX01.CN0438(7株),5个型别间相差1~4条带,相似性系数为89.5%~97.4%(图2)。有103个型别只包含1株菌,即有103株菌拥有独特的型别。375株CRKP的PFGE图谱相似性系数在37.8%~100%之间。(2)优势型别的时间和病区分布:KPX01.CN0014菌株分布于2013年10月之前,首次于2010年5月出现在重症监护室,随后扩散至7个其他病区,在病区分布上集中在重症监护室(9株,25.0%)和康复病房(14株,38.9%)。KPX01.CN0058首次于2014年2月出现在神经内科病房,随后在神经内科病房一直存在,并且扩散至13个其他病区,在病区分布上集中在急诊抢救室(43株,33.6%)、神经内科病房(20株,15.6%)、急诊留观病房(18株,14.1%)。KPX01.CN0265首次于2013年10月分离自急诊抢救室,随后4个月内在急诊留观病房持续被分离到。KPX01.CN0268菌株分布于2011年4月至2014年4月,在5个病区被分离到。KPX01.CN0438菌株分布于2014年4月至2015年6月,7株菌均分别分布在不同的病区。详见图3

图1375株CRKP的PFGE分型和15株CRKP的MLST及抗生素耐药基因检测结果
图2375株耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌中5个PFGE优势型别聚类图
图3375株耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌中5个PFGE优势型别的时间和病区分布

3. MLST分型和耐药基因检测结果:  (1)MLST分型:15株进行MLST分型和碳青霉烯类抗生素常见耐药基因检测的CRKP菌株中,有13株的MLST分型为ST11型,且携带KPC-2耐药基因,其中包括6株上述结果中5种PFGE型别(包含的菌株数大于5株)的菌株和7株其他PFGE型别的菌株。另外两株菌的MLST型别分别为ST37和ST846,其中ST846型菌株携带IMP-4基因,ST37型菌株中未检出5种目标耐药基因。详见图1。(2)耐药基因检测:将A1502的序列数据与NCBI数据库比对,检索到34个已公布的质粒序列,其中20个是肺炎克雷伯菌的耐药质粒(携带β-内酰胺酶和/或碳青霉烯酶耐药基因),其余14个是其他肠杆菌科细菌(大肠杆菌、阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌等)的耐药质粒。通过检索ARDB数据库,A1502的质粒序列中存在12个耐药基因,包括碳青霉烯类、头孢菌素、甲氧苄氨嘧啶、磷霉素、氯霉素、大环内酯类等抗生素的耐药相关基因以及3个多耐药外排泵。详见表2

表2菌株A1502携带不同耐药基因时与NCBI数据库中已公布序列的一致性及耐受的相关抗生素

4.全基因组分型结果:  在3种聚类树中,A1502均与同时期分离自北京其他医院的菌株聚集成簇,而与分离自上海、杭州的菌株以及ATCC BAA-2146的聚类关系较远。详见图4

图4采用3种不同方法构建9株ST11型耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌聚类树

讨论  CRKP引起的感染病例日益增多,暴发事件屡有报道,病死率高[18]。据全国耐药监测网数据,我国临床分离的肺炎克雷伯菌中CRKP所占的比例为7%~10%左右,但是在不同地区、不同医院耐药率高低不一[19,20]。2009年以前,我国的CRKP主要集中在浙江和江苏;但在其后的数年间,全国各地均有CRKP的分离和报道[9,11]。近年我国临床分离的肺炎克雷伯菌中CRKP阳性率大幅度增加[4,5],以及多起院内感染暴发事件的发生[21,22],提示我国存在CRKP的社区性和医院内传播扩散。在众多的细菌分子分型方法中,PFGE由于其分辨力高、重复性好被认为是分型的"金标准"[23,24]。在本研究中,PFGE结果提示CRKP菌株存在病区内或院内不同病区间的传播。同时一部分菌株PFGE带型与该院优势带型差别大,推测这些菌株是社区获得性耐药,该结果提示CRKP菌株在北京市健康人群中存在一定数量的分布。
        本研究先应用PFGE对所有菌株进行分型,揭示该院CRKP群体的基因型别特征以及院内传播情况;进而挑选代表菌株开展MLST分型,揭示该医院的优势PFGE型别菌株属于ST11型菌株。这种组合和实验步骤,在达到揭示菌株分型和克隆特征目的的同时,节省了实验成本。联合MLST和耐药基因检测结果,可以推断该医院分离的CRKP以携带KPC-2基因的ST11型为主。携带KPC-2基因的ST11型菌株是我国临床分离CRKP的优势克隆群[9,10],而且有过数起由该克隆群菌株引起的院内感染暴发事件的报道[21,25,26,27]。本研究还检测出1株携带IMP型耐药基因的CRKP菌株。KPC型和IMP型基因一般位于可转移的质粒上,由于质粒介导的酶容易通过质粒的传递将耐药基因传递给同种不同株或甚至不同种的细菌,因而在细菌耐药性的传播中具有非常重要的意义。另外需要引起重视的是,通过全基因组测序和序列分析的方法,揭示A1502中可能存在1个或者多个耐药质粒。在同时自该菌株中除了检出KPC-2基因之外,还发现了编码A类β-内酰胺酶的SHV-2型基因。假如这两个基因位于同一个质粒上,就意味着一个质粒的转移就可以导致受体菌对多种抗生素耐药,包括头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素。虽然本研究所使用的基因组测序方法不能确证这两个耐药基因位于同一个质粒上,但即使不在同一个质粒上,这类多重耐药菌引起的感染性疾病在临床治疗中已是非常棘手。
        基于全基因组测序的分型方法已经被成功应用于多重耐药肺炎克雷伯菌的暴发调查和传播途径追踪[21, 28,29]。本研究应用全基因组测定方法,基于3种方法将该医院的优势克隆群代表菌株与国内同克隆群菌株以及国际参考菌株进行了种群结构分析。结果显示,北京地区6家医院分离的菌株呈现高度的遗传聚集性,而与浙江和上海的菌株遗传进化关系较远,提示在携带KPC-2基因的ST11型克隆群内,北京本地可能存在一个在不同医院间传播的亚克隆群。
        综上所述,本研究通过传统的分子分型技术(PFGE、MLST)和基于基因组测序的新一代分型技术,揭示了CRKP优势克隆群(携带KPC-2基因的ST11型克隆群)存在医院内和医院间传播扩散。这应该引起公共卫生部门和医疗机构的重视,采取防控措施以监测和控制该克隆群的传播扩散。

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