中华预防医学杂志    2017年12期 O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖模式的建立及与O139血清群霍乱弧菌定殖能力比较     文章点击量:442    
中华预防医学杂志2017年12期
中华医学会主办。
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王嘉正 闫梅英 卢昕 阚飙
WangJiazheng,YanMeiying,LuXin,KanBiao
O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖模式的建立及与O139血清群霍乱弧菌定殖能力比较
Comparison of colonization ability of O1 and O139 Vibrio cholerae strains on soft-shelled turtle's surface
中华预防医学杂志, 2017,51(12)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.12.010

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投稿日期: 2017-02-20
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O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖模式的建立及与O139血清群霍乱弧菌定殖能力比较
王嘉正 闫梅英 卢昕 阚飙     
王嘉正 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室
闫梅英 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室
卢昕 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室
阚飙 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室
摘要: 目的  分析O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖能力,并比较O1与O139血清群霍乱弧菌菌株在甲鱼体表定殖能力的差异。方法  所用O1及O139血清群霍乱弧菌均为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室保存,各4株。实验用甲鱼选择背甲直径约9 cm、体重约150 g的甲鱼,共63只。利用小动物活体成像直接观察生物发光标记的O1血清群霍乱弧菌菌株在甲鱼体表的定居部位及增殖;构建O1血清群霍乱弧菌主要定居因子的基因缺失株(mshAgbpAtcpA基因),通过竞争定殖实验计算竞争定殖系数(CI),分析O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖的主要决定因子;对O1及O139血清群霍乱弧菌两两配对,组成16个竞争组,通过竞争定殖实验比较两种血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖能力的差异。结果  O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖具有位置聚集性,以甲鱼背部裙边和背甲定殖最强,腹甲定殖很少。竞争定殖实验显示,mshA基因缺失后,O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖能力下降了7.26倍。16个竞争组中有11组的CI值(O139/O1)大于2,在2.07~59.84之间;有2组分别为1.43及0.93;有3组的CI值低于0.7。结论  确定了霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖部位;mshA基因为O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖时发挥作用的主要定居因子;O139血清群菌株比O1血清群菌株有更强的定殖优势,且直接分离自甲鱼的菌株定殖能力更强。
关键词 :弧菌,霍乱;弧菌,霍乱,O1;O139群霍乱弧菌;甲鱼
Comparison of colonization ability of O1 and O139 Vibrio cholerae strains on soft-shelled turtle's surface
WangJiazheng,YanMeiying,LuXin,KanBiao     
State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Kan Biao, Email:kanbiao@icdc.cn
Abstract:Objective  To study the preferred colonization sites of O1 Vibrio cholerae (V.cholerae) and the colonization ability difference for O1 and O139 V. cholerae on soft-shelled turtle's surface.Methods  8 O1 and O139 V. cholerae strains were obtained from branch of diarrheal diseases, Chinese center for disease control and prevention. 63 soft-shelled turtles weighing 150 g and 9 cm in length (diameter of calipash) were selected for use in the study. The preferred colonization sites and proliferation trend were studied by using bioluminescent imaging method. The colonization factors for O1 V. cholerae strains were studied by constructing colonization gene mutant strains (VC1897dmshA, VC1897dgbpA and VC1897dtcpA), performing competition colonization assays and analyzing the competitive indexes. After pairing off O1 and O139 strains respectively to perform 16 competition groups, the colonization difference of these two strains were studied by competition colonization assays.Results  The colonization sites by V. cholerae on soft-shelled turtles surfaces was clustered. More V. cholerae strains colonized on turtle's calipash and carapace on dorsal side and less strain colonized on ventral side. The competition colonization assays showed that colonization ability of O1 serogroup mshA mutant strains were 7.26 times lower than VC1897dlacZ. Besides, the CI value (O139/O1) of 11 out of the 16 competition groups were greater than 2 (between 2.07 and 59.84). Two groups showed values of 1.43 and 0.93 respectively and 3 groups lower than 0.7.Conclusion  The preferred colonization sites for O1 V. cholerae strains on body surface were observed.MSHA was one of the main colonization factors for its colonization. Our study suggested that in general, O139 V. cholerae strains have stronger colonization ability than O1 strains. Besides, strains isolated from soft-shelled turtles tend to have stronger colonization ability than strains isolated from patients.
Key words :Vibrio cholerae;Vibrio cholerae O1;O139 vibrio cholerae;soft-shelled turtle
全文

霍乱弧菌是人类烈性肠道传染病——霍乱的病原体。根据菌体脂多糖抗原的不同,该菌可被分成200多个血清群,但目前只有O1血清群和O139血清群的产毒株引起了霍乱流行。
        近些年我国霍乱发病率明显下降,但仍有O1血清群El Tor型和O139血清群菌株引起的霍乱疫情发生,尤其是聚餐暴发[1]。在一些霍乱疫情中,流行病学分析提示其感染来源与甲鱼高度相关[2,3,4,5],通过分子分型溯源分析,也证明了这种关联[6,7,8]。食物加工过程中生熟不分、甲鱼携带的霍乱弧菌造成交叉污染已成为食源性疾病尤其是霍乱暴发的一个不可忽视的原因[9]。在对市售甲鱼的调查中,O1和O139血清群霍乱弧菌都能够被分离到[2,4,5,10,11],并且甲鱼中霍乱弧菌分离率明显高于其他水产品[12,13]。但至目前,食用甲鱼所致的霍乱疫情,几乎都是由O139血清群霍乱弧菌感染所致。
        本研究利用活体成像技术直接观察O139血清群霍乱弧菌在甲鱼体表和肠道内的黏附定居,发现主要定殖因子中,毒素共调菌毛(toxin-coregulated pili,TCP)和几丁质结合蛋白(N-acetyl glucosamine-binding protein A,GBP)对于菌株在甲鱼肠道内的定殖发挥重要作用,MSHA菌毛则是甲鱼体表定殖的主要因子。考虑到在监测中发现O139血清群霍乱弧菌相对于O1血清群有更高的分离率,尤其是与食用甲鱼相关的霍乱聚餐暴发中,绝大多数暴发病原为O139血清群菌株,因此本研究分析了O139血清群菌株是否比O1血清群具有更强的甲鱼定殖能力,现将研究结果报告如下。

菌株与方法  

一、菌株  本研究所用O1及O139血清群霍乱弧菌均为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室保存,各4株,这些菌株分离自2000—2012年,分离地点覆盖我国7个省份,分离来源为甲鱼或腹泻病例。详见表1。所有菌株均天然耐受多黏菌素B抗生素。

表12000—2012年O1及O139血清群霍乱弧菌菌株基本情况

二、甲鱼选择及预处理  实验用甲鱼购自上海市铜州路水产养殖公司,选择背甲直径约9 cm、体重约150 g的甲鱼作为实验用动物,共63只。实验前先进行甲鱼体表及肛门拭子的采集,置于碱性蛋白胨水增菌(北京陆桥技术股份有限公司,中国)和霍乱弧菌分离培养检测,选择霍乱弧菌分离为阴性的甲鱼用于后续实验。甲鱼饲料购自上海市铜州路水产养殖公司,经高压灭菌后用于实验研究。甲鱼养殖用水是NaCl浓度为10 mg/ml的煮沸并冷却至室温的自来水。

三、甲鱼体表生物发光成像实验  

1.生物发光霍乱弧菌构建:  生物发光质粒pXEN-pmdh-luxCDABE为本实验室保存,构建方法参照文献[15]所示。通过电转化的方法将质粒pXEN-pmdh-luxCDABE分别转化到O1血清群霍乱弧菌VC1897及O139血清群霍乱弧菌VC5529中。之后,将重组霍乱弧菌涂布于含有氨苄西林(100 μg/ml)的LB琼脂培养基(Luria-Bertani agar plate,LBA)上,待菌落长出后利用In-Vivo FX Pro成像仪进行生物发光成像。筛选发光信号相对较强的菌落,得到生物发光菌株VC1897(pXEN-pmdh-luxCDABE)和VC5529(pXEN-pmdh-luxCDABE),用于小动物成像分析。

2.甲鱼体表生物发光成像实验:  O1血清群生物发光菌株VC1897(pXEN-pmdh-luxCDABE)和O139血清群生物发光菌株VC5529(pXEN-pmdh-luxCDABE)分别在氨苄西林浓度为100 μg/ml的LB平板上于37 ℃培养过夜。次日,刮取平板上的菌落并分别悬浮于30 ml氨苄西林浓度为100 μg/ml的无菌PBS中,调整浊度至吸光度为1.0。之后,分别将菌液添加到3 L氨苄西林浓度为100 μg/ml及NaCl浓度为10 mg/ml的无菌自来水中,作为体表感染的菌液。采用浸泡的方法对甲鱼进行体表定殖实验,浸泡感染的时间为2 h,在室温为28 ℃的环境中进行;2 h后,取出甲鱼并放入氨苄西林浓度为100 μg/ml及NaCl浓度为10 mg/ml的无菌自来水中进行2次漂洗,以去除在甲鱼体表未发生定殖的霍乱弧菌;之后,将甲鱼放入氨苄西林浓度为100 μg/ml及NaCl浓度为10 mg/ml的无菌自来水中继续养殖(室温约为28 ℃);每隔24 h进行一次漂洗和甲鱼养殖液的更换(氨苄西林浓度为100 μg/ml及NaCl浓度为10 mg/ml的无菌自来水)。在感染后的24 h和72 h,分别对甲鱼进行麻醉并用In-Vivo FX Pro小动物成像仪进行生物发光成像的观察。在感染之前,对甲鱼进行麻醉和生物发光成像的观察作为对照,以确保感染之前,甲鱼体表并不携带霍乱弧菌,也无法产生生物发光信号。2种血清群霍乱弧菌各重复实验3次,共使用甲鱼6只。

四、O1血清群霍乱弧菌野生株与基因缺失株的体表竞争定殖实验  

1.霍乱弧菌基因缺失株的构建:  以O1血清群霍乱弧菌VC1897作为出发菌株,采用同源重组法进行黏附基因缺失株的构建。以VC1897染色体DNA为模板扩增目标基因的侧翼序列并进行搭桥连接(引物序列见表2)。切胶回收的搭桥PCR产物经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后克隆于自杀质粒pWM91以得到重组质粒pWM91-ΔmshA、pWM91-ΔgbpA以及pWM91-ΔtcpA。重组质粒转化大肠杆菌DH5αλpir后筛选阳性克隆,测序验证。验证正确的重组质粒分别转化到大肠杆菌SM10λpir中作为供体菌,以VC1897霍乱弧菌为受体菌进行接合转移实验。在含有多黏菌素B和氨苄西林抗生素的LB固体平板上筛选接合子。双抗平板上长出的阳性接合子经2次同源重组后,挑取在含100 mg/ml蔗糖的LB平板上生长,而在含氨苄西林抗生素的LB平板上不生长的阳性重组株,以相应引物扩增并测序验证,以保证基因缺失的正确性。

表2重组生物发光质粒及基因缺失株构建的引物序列及酶切位点
因为lacZ基因的缺失株在含有X-gal(TaKaRa公司,日本)的固体培养基上会呈现出白色菌落,而含有lacZ基因的菌株(VC1897dmshA,VC1897dgbpA,VC1897dtcpA)其菌落会呈现出蓝色。通过此方法,可对竞争定殖实验中分离到的不同颜色的菌落直接计数。因此,参照乳鼠定殖模型中的菌落计数方法[14],对O1血清群霍乱弧菌VC1897、O139血清群霍乱弧菌VC4251、VC5529、VC474、VC584的lacZ基因也进行了缺失,方法同上所述。

2.O1血清群霍乱弧菌野生株与基因缺失株的体表竞争定殖实验:  将菌株VC1897dlacZ和黏附基因缺失突变株(VC1897dmshA、VC1897dgbpA和VC1897dtcpA)分别接种到LB琼脂平板上于37 ℃孵箱中培养过夜。次日,刮取平板上的霍乱弧菌悬浮于PBS中,调整各菌株的菌液浓度吸光度至1.0(约为109 CFU/ml)。并对感染菌液分别进行菌落计数以计算感染菌量比值(input值)。VC1897dlacZ和各黏附基因缺失突变株各取1.5 ml并以1∶1的比例混合均匀。将3 ml混合菌液加入到3 L NaCl浓度为10 mg/ml的无菌自来水中,作为感染液。之后将甲鱼浸没于感染液中2 h。感染结束后用NaCl浓度为10 mg/ml的无菌自来水中对甲鱼进行2次漂洗。漂洗后的甲鱼再放入3 L NaCl浓度为10 mg/ml的无菌自来水中于28 ℃进行养殖。感染后每24小时对甲鱼进行1次漂洗,并更换养殖液。在感染后的第72小时对甲鱼再次进行漂洗并用无菌棉签采集体表涂抹样(涂抹甲鱼裙边部分)。涂抹样稀释成3个梯度涂布于含有多黏菌素B和X-gal的LB琼脂平板上。次日,进行菌落计数,计算检出菌量比值(output值)。3组黏附基因缺失突变株的竞争定殖实验各重复3次,共使用9只甲鱼。
        竞争定殖系数(competitive index,CI)=output/input,其中output和input值均基因缺失株的菌量除以野生株的菌量计算。

五、O139血清群霍乱弧菌与O1血清群霍乱弧菌的竞争定殖实验  

1.菌株生长曲线测定:  霍乱弧菌在37 ℃培养箱中培养过夜。次日,刮取平板上的菌落,悬浮于LB液体培养基中并调整所有细菌的浊度至吸光度为1.0(约为109 CFU/ml)。按照1:1 000的比例将菌液接种于新鲜的LB液体培养基中,于28 ℃培养条件下继续培养,每隔1 h对各菌株进行1次吸光度浊度的测定,直到细菌生长至平台期为止,并应用Graphpad prism软件绘制生长曲线。

2.O139血清群霍乱弧菌与O1血清群霍乱弧菌竞争定殖实验:  通过生长曲线的测定,8株实验菌株生长曲线几乎重合,其生长能力十分接近。将4株O139血清群霍乱弧菌的lacZ基因缺失株与4株O1血清群霍乱弧菌野生型菌株两两配对,产生16个竞争组,按照前述试验方法分别进行竞争定殖实验。Output值和input值均以O139血清群霍乱弧菌菌量除以O1血清群霍乱弧菌菌量来计算。每组竞争定殖实验均进行3只甲鱼的重复,共使用甲鱼48只。

结果  

一、甲鱼体表生物发光成像  两组生物发光成像实验均在感染后的24 h于甲鱼背面裙边区域呈现较为明显的发光,随后发光面积在背部甲壳逐渐增加,甲鱼背面的四肢及脖颈部也呈现出了一定程度的发光。在甲鱼的腹面,发光部位则相对较少且主要集中在四肢上,腹面的甲壳、裙边以及颈部表面则几乎没有观察到发光。O1血清群菌株在定殖部位及发光变化趋势上均与O139血清群菌株相似(图1)。

图1O1血清群及O139血清群霍乱弧菌感染甲鱼体表后生物发光成像

二、O1血清群霍乱弧菌野生株与基因缺失株的体表竞争定殖实验  VC1897dgbpA株和VC1897dtcpA株与VC1897dlacZ株的CI值分别为1.09和1.16,均接近于1,提示gbpA和tcpA基因缺失并没有引起O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖能力的下降。而VC1897dmshA株与VC1897dlacZ株的CI值为0.138,即mshA基因缺失后,O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖能力下降了7.26倍(图2)。

图2VC1897dlacZ株与基因缺失株VC1897dmshA、VC1897dgbpA和VC1897dtcpA在甲鱼体表的竞争定殖实验

三、O139血清群霍乱弧菌与O1血清群霍乱弧菌的竞争定殖实验  

1.血清群间CI值比较:  16组中有11组的CI值(O139血清群/O1血清群)大于2,在2.07~59.84之间;有2组分别为1.43及0.93,显示为相似的定殖能力;有3组的CI值(O139血清群/O1血清群)低于0.7。详见表3

表3O139与O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的竞争定殖系数比较

2.不同分离来源菌株间CI值比较:  2株O139血清群甲鱼分离株(VC4251和VC5529)高过所有O1血清群菌株的定殖能力。2株O1血清群甲鱼分离株(VC1897和VC5520)的定殖能力则均低于O139血清群甲鱼分离株;但与1株O139血清群腹泻病例株(VC474)定殖能力相近,并表现出高于另1株O139血清群腹泻病例株(VC584)的定殖能力。而O1血清群腹泻病例株的定殖能力则较弱,除与1株O139血清群腹泻病例株(VC584)表现出相近的定殖能力外,其定殖能力均弱于其他3株O139血清群菌株。详见表3

讨论  我国O139血清群霍乱弧菌导致的疫情多表现为散发或小范围的暴发,其中暴发疫情多是由农村、城乡结合部等一些卫生条件较差地区的聚餐所引起。一些流行病学和病原学分析发现其感染来源与甲鱼高度相关,由甲鱼引起的霍乱弧菌食源性感染已成为O139血清群霍乱暴发的重要原因之一。这也提示霍乱弧菌可能在甲鱼体表具有较强的定殖能力,从而为其传播提供了条件。之前的研究已经发现O139血清群霍乱弧菌能够在甲鱼体表定殖且定殖呈现出区域性的聚集状态[15]。而O1血清群是否具有在甲鱼体表的定殖能力,以及与O139血清群相比定殖能力如何是本研究的重点。
        本研究利用甲鱼体表定殖的直接成像观察发现,O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表也表现出了与O139血清群菌株相似的定殖状态,其定殖同样具有区域聚集性,且在甲鱼裙边上的定殖能力最强,在甲鱼体表定殖之后能够继续增殖。作为一种水生生物,甲鱼体表的肌肉和皮肤中都含有一定量的胶原蛋白,特别是甲鱼的裙边结构,胶原蛋白含量非常丰富[16,17]。霍乱弧菌通过Ⅱ型分泌系统能够分泌胶原蛋白酶[18],因此可以水解利用胶原蛋白作为营养物质,从而在甲鱼体表黏附之后进一步增殖。
        利用哺乳动物、浮游生物等霍乱弧菌感染模型,已证明MSHA、TCP、GBP为霍乱弧菌的三个重要定居因子。其中,MSHA是霍乱弧菌定居于浮游生物表面的重要因子,而TCP和GBP在霍乱弧菌定殖于哺乳动物小肠时发挥主要作用[19,20,21]。本研究结果显示MSHA也是O1血清群菌株在甲鱼体表的重要定居因子,而TCP和GBP在甲鱼体表定居中没有明显的作用。这与以前对O139血清群菌株在甲鱼体表的定殖研究结果相似,提示一些重要的定殖因子在O1血清群及O139血清群霍乱弧菌中发挥着相似的定殖作用。
        在对水产品霍乱弧菌的监测中,O1血清群、O139血清群菌株都能够被检测到[10,22],但由聚餐并食用甲鱼而引起的霍乱暴发则几乎均是由O139血清群菌株引起,并且从甲鱼中分离到的霍乱弧菌主要为O139血清群[2,3,4,5,6,7,8,9,10]。本研究使用多株O1和O139血清群菌株,设置了16组"O139血清群/O1血清群"的菌株比较,其中包含了直接分离自甲鱼以及分离自腹泻病例的菌株,对比了O1及O139血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖能力。综合比较发现O139血清群菌株的定殖能力强于O1血清群,甲鱼分离株的定殖能力要强于腹泻病例分离株。这些结果提示了在甲鱼体表不同霍乱弧菌菌株具有不同的定殖能力。由于自然筛选的过程,直接分离自甲鱼的菌株有更强的甲鱼体表定殖能力,而对于腹泻病例来源的菌株,因没有经过定殖甲鱼这一过程的筛选,一些腹泻病例来源菌株可能具有较强的定殖能力,而另一些菌株的定殖能力则可能较弱。这样的差别可能是由不同菌株定居因子(如MSHA)表达水平的差异以及对甲鱼体表营养利用能力的差别等机制所造成。
        综上所述,本研究明确了O1血清群霍乱弧菌能够定殖在甲鱼体表及在甲鱼体表定殖时MSHA菌毛发挥重要的作用。通过使用多株菌株的成对比较发现相对于O1血清群来说,O139血清群菌株具有相对较强的定殖能力,这可能是O139血清群菌株在甲鱼体表更容易定殖且分离率更高的原因。本研究的数据为进一步研究这些定居能力差异的机制提供了基础。

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