中华预防医学杂志    2017年12期 贵州2012—2015年风疹病毒分离株基因特征分析    PDF     文章点击量:620    
中华预防医学杂志2017年12期
中华医学会主办。
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唐小敏 朱贞 任刚 叶绪芳 张丽
TangXiaomin,ZhuZhen,RenGang,YeXufang,ZhangLi
贵州2012—2015年风疹病毒分离株基因特征分析
Genetic characterization of rubella virus isolated in Guizhou Province from 2012 to 2015
中华预防医学杂志, 2017,51(12)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.12.011

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投稿日期: 2017-01-18
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贵州2012—2015年风疹病毒分离株基因特征分析
唐小敏 朱贞 任刚 叶绪芳 张丽     
唐小敏 550004 贵阳,贵州省疾病预防控制中心免疫规划所
朱贞 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
任刚 550004 贵阳,贵州省疾病预防控制中心免疫规划所
叶绪芳 550004 贵阳,贵州省疾病预防控制中心免疫规划所
张丽 550004 贵阳,贵州省疾病预防控制中心免疫规划所
摘要: 目的  分析贵州2012—2015年风疹病毒分离株基因特征。方法  于2012—2015年贵州省麻疹网络实验室共采集390例疑似麻疹病例,并从中诊断出25例风疹病例,使用Vero/SLAM细胞进行病毒分离。经Real-time RT-PCR方法鉴定为阳性的风疹病毒分离株,采用RT-PCR方法扩增风疹病毒E1基因两个核苷酸片段(480 bp和633 bp),在对扩增产物进行序列测定和拼接后,基于基因定型靶基因(739 bp)进行基因特征分析。结果  25例疑似风疹病例中,19例为风疹暴发病例,6例为风疹散发病例;男性11例(44.0%),女性14例(56.0%),年龄为(12.3±3.9)岁;共分离到10株风疹病毒株,7株为1E基因型,3株为2B基因型。7株1E基因型间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%~100%和100%;3株2B基因型间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%~100%和99.5%~100%。10株风疹病毒在E1糖蛋白基因Asn 177、Asn 209 N-型糖基化位点以及位于213~285 aa之间E1抗原表位未发生变异。其中,7株1E基因型在第338位氨基酸由亮氨酸变异为苯丙氨酸;2株2B基因型在第377位氨基酸由缬氨酸变异为丙氨酸。结论  2012—2015年在贵州传播流行的风疹病毒是由1E和2B基因型引起;10株风疹病毒株在核苷酸和氨基酸序列水平上高度保守,重要功能位点均未发生变异。
关键词 :风疹病毒;基因型;序列分析
Genetic characterization of rubella virus isolated in Guizhou Province from 2012 to 2015
TangXiaomin,ZhuZhen,RenGang,YeXufang,ZhangLi     
Department of Immunization Programs, Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004, China
Corresponding author: Zhang Li,Email:450338011@qq.com
Abstract:Objective  To analyze the genetic characteristics of rubella virus isolated from 2012 to 2015 in Guizhou province.Methods  A total of 390 cases of suspected measles were collected from Guizhou measles network laboratory from 2012 to 2015 and 25 cases of rubella cases were diagnosed. Rubella virus isolation was performed using Vero/SLAM cells. The presence of rubella viral RNA was detected using Real-time RT-PCR after RNA extraction from infected tissue culture cells. Fragments of 480 bp and 633 bp nucleotides of E1 genes of the isolates were amplified by RT-PCR and the PCR products were sequenced and spliced. The phylogenetic tree was conducted based on the 739 bp nucleotide sequences of E1 genes and gene characteristic analysis was performed.Results  There were 19 cases of rubella outbreaks and 6 cases of rubella sporadic cases in 25 cases of suspected rubella cases. There were 11 males (44.0%) and 14 females (56.0%). The mean age and standard deviation were (12.3±3.9) years. A total of 10 rubella strains were isolated. The results of phylogenetic analysis showed that 7 strains of rubella virus isolates belonged to genotype 1E and the other belonged to genotype 2B. The nucleotide acid and amino acid homology among 7 strains 1E genotype were 99.0%-100% and 100% respectively. 2B genotype of 3 strains of nucleotide and amino acid homology were 99.4%-100% and 99.5%-100% respectively. Ten strains of rubella virus were not mutated in the E1 glycoprotein gene, Asn 177 and Asn 209 N-type glycosylation sites and E1 antigen epitopes between 213 and 285aa.Among them, 7 strains of 1E genotype had a mutation from leucine to phenylalanine in 338 amino acid, 2 strains of 2B genotype at 377 amino acids from valine to alanine.Conclusion  Rubella virus epidemic was caused by 1E and 2B genotypes in Guizhou from 2012 to 2015.Ten strains of rubella virus were highly conserved in nucleotide and amino acid sequences and there was no variation of important functional sites.
Key words :Rubella virus;Genotype;Sequence analysis
全文

风疹病毒可引起以发热和出疹为主要临床症状的急性呼吸道传染病,妊娠期妇女早期感染风疹病毒,可引起胎儿流产、死亡或婴儿出生后出现以多器官严重损伤为主要表现的先天性风疹综合征(congenital rubella syndrome,CRS)[1,2]。风疹病毒属于披膜病毒科(Togaviridae)风疹病毒属(Rubivirus),单股正链有包膜的RNA病毒;基因组包括2个非结构蛋白(P150、P90)和3个病毒结构蛋白(C、E2、E1)[3]。风疹病毒只有1个血清型,但有多个基因型,WHO推荐将E1基因的739个核苷酸(8 731~9 469 nt,159~404 aa)作为基因型划分和分子流行病学研究的标准靶核苷酸序列[4],目前全球将风疹病毒分为两个进化支共13个基因型,包括12个明确的基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C)和1个临时基因型(1a)[5,6]。为了解贵州风疹病毒基因特征及变异趋势,积累风疹病毒分子流行病学基线数据,本研究对贵州2012—2015年风疹暴发或散发病例中分离到的风疹病毒进行基因分型及基因特征分析,现将结果报告如下。

材料与方法  

1.标本:  于2012—2015年,依托贵州省麻疹网络实验室监测系统,参照《全国麻疹监测方案》[7],共采集390例疑似麻疹病例。按风疹诊断标准(WS 297-2008)[8]从中诊断出25例风疹病例。病例标本由就诊地疾病预防控制中心(center for disease control and prevention,CDC)专业技术人员负责采集,然后将标本(咽拭子)置于2 ml标本运输液中(含Hank's基础液、牛血清白蛋白、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml等),2~8 ℃冷藏送检至贵州省CDC麻疹/风疹实验室进行病毒分离培养。

2.病毒分离:  淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞(Vero/SLAM细胞)经传代培养,长成合适的单层细胞后弃生长液,接种0.2 ml临床咽拭子标本,置37 ℃恒温培养箱吸附2 h后弃标本液,换维持液置35 ℃,体积分数为5%的CO2培养箱分离培养,连续培养7 d,倒置显微镜逐日观察细胞病变(cytopathic effecte,CPE),同时设细胞培养阴性对照(只加细胞维持液)。风疹病毒细胞盲传3代,每代病毒分离物置-70 ℃冻存。Vero/SLAM细胞由中国CDC国家麻疹/风疹实验室提供。

3.病毒RNA的提取和鉴定:  使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(德国Qiagen公司)从分离培养的标本细胞培养液中提取病毒RNA,具体操作参照说明书。使用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time reverse transcript-polymerase chain reaction, Real-time RT-PCR)检测风疹病毒核酸的存在。Real-time RT-PCR反应体系参照江苏和创生物科技有限公司麻疹/风疹双通道荧光检测试剂说明书配制,于ABI 7500型荧光PCR仪上进行反应。

4.标准靶核苷酸序列的扩增和测定:  经鉴定为阳性的风疹毒株,进行常规分子流行病学研究所用的标准靶核苷酸序列扩增。使用Qiagen One-step RT-PCR kit试剂盒(德国Qiagen公司)分别扩增E1基因两个片段:480个核苷酸片段(8 633~9 112 nt)和633个核苷酸片段(8 945~9 577 nt)[9]。反应条件为50 ℃ 30 min,95 ℃ 15 min。95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循环40次;72 ℃延伸10 min,扩增产物经1.5%琼脂凝胶电泳及Gel Doc XRS+凝胶成像系统分析。

5.序列测定和分析:  扩增产物送中国CDC国家麻疹/风疹实验室进行测序。使用Sequencher 5.0软件,将480个和633个核苷酸片段序列拼接成所需的739个核苷酸片段(8 731~9 469 nt)。同时从美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI) GenBank库中下载WHO 13个基因型的32株风疹病毒参考株序列,以及我国6个省份(江西、安徽、吉林、广西、重庆和湖南)同期流行的1E和2B风疹病毒基因序列,使用MEGA 6.0软件进行多序列比对以及核苷酸和氨基酸同源性分析[10],并采用邻接法(bootstraps=1 000)构建基因亲缘关系树。

结果  

1.基本情况:  25例疑似风疹病例中,19例为风疹暴发病例,6例为风疹散发病例;男性11例,占44.0%,女性14例,占56.0%,年龄为(12.3±3.9)岁,范围为0.8~20岁。

2.病毒分离和鉴定:  25例临床咽拭子标本接种到Vero/SLAM细胞,未见明显CPE,经Real-time RT-PCR鉴定,从25例病例标本中共分离到10株风疹病毒,根据WHO标准命名方法对10株风疹病毒分离株进行命名。详见表1

表12012—2015年贵州10株风疹病毒分离株标准命名及基本情况

3.风疹病毒基因定型的靶核苷酸序列扩增:  10株风疹病毒分离株扩增E1基因480个核苷酸片段(8 633~9 112 nt)和633个核苷酸片段(8 945~9 577 nt),将RT-PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳约30 min,溴化乙锭染色后可见约480 bp和633 bp处分别有一条明显的阳性条带。

4.风疹病毒基因定型与基因亲缘性关系分析:  将分离到的10株风疹病毒与WHO 13个基因型32个参考株基于E1基因739个核苷酸序列构建基因亲缘性关系树,2012—2015年贵州10株风疹病毒分离株分别与WHO 1E、2B基因型参考株分别聚于不同的分支,其中7株为1E基因型(2012—2013年),与1E基因亚型参考株RVi-Shandong.CHN-0.02-1E接近;3株为2B基因型(2015年),与2B基因型参考株RVi-Washington.USA-16.00-2B接近,属于同一分支。详见图1。将10株风疹病毒分离株与我国6个省份同期流行的1E和2B基因型风疹病毒株一起构建基因亲缘关系树,贵州流行的1E和2B基因型风疹病毒分别与我国不同省份同期流行的1E和2B基因型风疹病毒高度同源,没有明显的地理和年代差异,提示这些病毒在不同年份和省份间持续流行和传播。详见图2

图12012—2015年贵州10株风疹病毒分离株与WHO各基因型参考株亲缘性关系树
图22012—2015年贵州10株风疹病毒分离株与部分省市同期风疹病毒流行株亲缘性关系树

5.核苷酸和氨基酸同源性分析:  10株风疹病毒分离株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.4%~100%和98.7%~100%。7株1E基因型核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%~100%和100%,与WHO 1E基因型参考株RVi-Shandong.CHN-0.02-1E、RVi-Kuala Lumpur.MYS-0.01-1E的核苷酸同源性分别为98.1%~98.9%、96.8%~97.6%;氨基酸同源性分别为100%、99.5%。3株2B基因型核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%~100%和99.5%~100%,与WHO 2B基因型参考株RVi-Washington.USA-16.00-2B、RVi-Anhui.CHN-0.00-2-2B、RVi-TelAviv.ISR-0.68-2B的核苷酸同源性分别为97.8%~98.1%、96.3%~96.6%、94.4%~94.7%;氨基酸同源性分别为99.5%~100%、99.1%~99.5%、99.1%~99.5%。

6.氨基酸变异分析:  2012—2015年贵州10株风疹病毒分离株与WHO各基因型参考株基于739个核苷酸,使用MEGA软件经核苷酸推导出氨基酸序列进行比对,结果显示:10株风疹病毒氨基酸序列比较保守,在E1糖蛋白基因Asn 177、Asn 209 N-型糖基化位点以及位于213~285 aa之间E1抗原表位未发生变异。其中,7株1E基因型(Guizhou2012-2、Guizhou2012-3、Guizhou2012-4、Guizhou2012-6、Guizhou2012-7、Guizhou2013-36、Guizhou2013-37)在第338位氨基酸由亮氨酸变异为苯丙氨酸;2株2B基因型(Guizhou2015-135、Guizhou2015-136)在第377位氨基酸由缬氨酸变异为丙氨酸。

讨论  贵州麻疹网络实验室自2003年成立以来[11],逐步扩大为9个市(州)及相关县级实验室,以前只对疑似麻疹病例进行鉴别诊断时进行风疹病毒血清学检测,之后逐步将风疹纳入网络实验室并开展了风疹病毒的分离培养及分子流行病学研究,对明确病毒的来源、传播途径及其变异趋势有着重要意义;同时,进行连续的风疹病毒分子流行病学监测还能追踪病毒基因型别变化和流行趋势,为风疹防制和消除提供重要的参考。
        1999—2009年中国风疹病毒学监测数据显示,在我国至少检测出4个基因型(1E、1F、2A、2B)[12];而1999—2002年风疹病毒是以1E和1F为主要流行基因型[13],随后2003—2009年分子流行病学监测表明,1E基因型替代其他基因型逐渐成为我国风疹病毒流行的优势基因型[14,15];1F基因型从2002年到目前为止未检测到[16];2A基因型只在疫苗相关病例中发现。2000—2008年2B基因型在我国部分省市能检测到[6],但近几年在全国范围内出现2B基因型病毒广泛流行[17,18,19],并且与2000—2008年检测到的2B基因型基因亲缘关系不同[13],可能表明2B基因型已建立了稳定的循环,成为本土优势流行株,且在我国范围内与1E基因型呈共同流行传播趋势。
        10株风疹病毒分离株与WHO各基因型参考株构建的基因亲缘关系树显示,7株为1E基因型风疹病毒(2012—2013年),3株为2B基因型风疹病毒(2015年)。7株1E基因型之间及3株2B基因型之间核苷酸和氨基酸高度同源;同一分支中与不同年份和部分省市流行的风疹病毒高度同源,表明同一病毒在不同年份、不同省份间流行和传播。由于贵州风疹病毒监测力度不够,目前仅从毕节、黔南州、黔东南州、六盘水获得少量病毒株。总体来说贵州标本采集率低、样本偏少,病毒检出率不高,空间分布不均衡、持续时间不长,尚不能说明贵州风疹病毒基因型是否存在1E和2B基因型发生共同循环或者是2B替代1E成为贵州的优势流行株,因此数据有待进一步监测与证实。
        本研究发现贵州的10株风疹病毒分离株核苷酸和氨基酸水平高度保守,重要功能位点均未发生变化。但7株风疹病毒1E基因型仅在第338位由亮氨酸变异为苯丙氨酸,这个位点的变异与我国其他省市报道的一致[20,21];2015年1起风疹暴发疫情中得到的2株2B基因型在第377位由缬氨酸变异为丙氨酸。1E和2B基因型在第338和第377位点的变异不会引起重要E1糖蛋白结构和功能改变,但其变化的意义还有待进一步研究。
        贵州风疹病毒学监测环节还很薄弱,在实验室监测中有部分风疹病例Real-time RT-PCR检测虽为病毒核酸阳性,但病毒滴度较低,不能进行基因定型,这是由于样本受到采集时效性、采集质量以及运输、保存条件和病毒复制等诸多因素影响所造成。为了便于持续地监测,构建完整的分子流行病学基线数据,急需加强风疹病毒学监测力度及业务培训,提高病原学标本采集率和病毒分离率,为贵州风疹和CRS的防控工作提供一定的病毒学监测数据。

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