中华预防医学杂志    2018年01期 2009—2016年上海人冠状病毒OC43分子流行病学研究    PDF     文章点击量:419    
中华预防医学杂志2018年01期
中华医学会主办。
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杨懿婧 胡芸文
YangYijing,HuYunwen
2009—2016年上海人冠状病毒OC43分子流行病学研究
Molecular epidemiological study of human coronavirus OC43 in Shanghai from 2009-2016
中华预防医学杂志, 2018,52(1)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.01.011

文章历史

投稿日期: 2017-07-03
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2009—2016年上海人冠状病毒OC43分子流行病学研究
杨懿婧 胡芸文     
杨懿婧 325035 温州医科大学检验医学院,生命科学学院(现在上海市公共卫生临床中心,201508)
胡芸文 325035 温州医科大学检验医学院,生命科学学院
摘要: 目的  分析上海2009年11月至2016年4月人冠状病毒(HCoV)流行特征,以及HCoV-OC43基因型分布和变异变迁规律。方法  收集2009年11月至2016年4月期间上海7家哨点医院感染科急性呼吸道感染患者的临床资料和呼吸道样本,包括咽拭子、痰、鼻咽抽吸物和肺泡灌洗液,共6 059例。采用HCoV通用引物对患者样本进行检测并测序分型。HCoV-OC43阳性样本进一步采用特异性引物对刺突蛋白、依赖RNA的RNA聚合酶(RDRP)和核衣壳蛋白全基因进行扩增和测序,并通过全基因序列构建进化树对HCoV-OC43进行基因分型和进化分析。结果  共检出HCoV 63株(1.04%),其中HCoV-OC43检出数最多,为34株,其后依次是HCoV-229E和HCoV-HKU1,检出数分别为18和10株,而HCoV-NL63、重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)均未检出。29例HCoV-OC43阳性样本获得刺突蛋白、RDRP和核衣壳蛋白全基因序列,根据进化树分析显示,其中27例为D型,2例为B型,而其他基因型E、F、G均未检出,其中D型为主导基因型。进一步分析与HCoV-OC43进入宿主和中和抗体产生相关的刺突蛋白发现,刺突蛋白重要的功能结构域——N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)含有较多氨基酸变异和阳性选择位点,并伴有氨基酸插入/缺失。13个阳性选择位点均位于NTD或RBD,其中10个位于NTD,3个位于RBD。结论  2009—2016年,上海流行的HCoV主要为HCoV-OC43,其中D型为优势基因型。刺突蛋白的NTD区和RBD区是HCoV-OC43进化过程中的高变区域,伴有氨基酸替换、氨基酸插入/缺失。
关键词 :冠状病毒OC43,人;基因型;分子流行病学
Molecular epidemiological study of human coronavirus OC43 in Shanghai from 2009-2016
YangYijing,HuYunwen     
School of Laboratory Medicine and Life Science of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China (Department of Pathogen Diagnosis and Biosafety, Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China)
Corresponding author: Hu Yunwen, Email:ywhu0117@126.com
Abstract:Objective  To understand the epidemiological characteristics of Human coronavirus (HCoV), the patterns of emergence and circulation, and the genotype distribution of human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) from November, 2009 to April, 2016 in Shanghai.Methods  A total of 6 059 respiratory specimens, including pharyngeal swab, sputum, nasopharyngeal aspirates and alveolar lavage fluid, as well as relative clinical data were collected from patients with acute respiratory infections from seven sentinel hospitals during November, 2009 to April, 2016 in Shanghai. Respiratory specimens were tested by RT-PCR with HCoV-conserved primers and subsequently genotyped by DNA sequencing. Using specific primers to amplify and sequence full-length Spike (S), RNA-dependent RNA polymerase (RDRP) and nucleocapsid (N) gene from HCoV-OC43 positive samples. Further genotype and phylogenetic analysis of HCoV-OC43 were performed by conducting phylogenetic trees.Results  Among 6 059 patients, the total frequency of HCoV was 63 (1.04%), in which HCoV-OC43 was the most frequently detected species with 34 positive samples, followed by human coronavirus 229E (HCoV-229E) and human coronavirus HKU1 (HCoV-HKU1) with 18 and 10 positive sample respectively. However, other HCoV like human coronavirus NL63 (HCoV-NL63), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and Middle-East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), were not been detected, which illustrated that HCoV-OC43 was the dominant subtype. The full-length of S, RDRP and N gene were obtained from 29 HCoV-OC43 positive samples. According to the sequence-analysis, 27 of which was genotype D, 2 of which was genotype B and others genotype, including genotype E, F and G, were not detected. The result indicated that the genotype D may be the dominant genotype. Further analysis of S protein that help HCoV-OC43 to entry host cell and stimulate the host immune system to produce neutralizing antibody found that two important functional domains in S protein, N-terminal domain (NTD) and receptor-binding domain (RBD) contained more amino acid substitution and positive selection sites, accompanied with amino acid insertion/deletion. 13 positive selection sites were all located in the NTD or RBD, 10 of which were located in the NTD and 3 in the RBD.Conclusion  Human coronavirus OC43 was the major circulation human coronaviurs in Shanghai from 2009 to 2016, in which genotype D was the dominant genotype. NTD and RBD regions of the S protein were hypervariable region during HCoV-OC43 evolution, and had amino acid substitutions as well as amino acid insertion/deletion.
Key words :Coronavirus OC43, human;Genotype;Molecular epidemiology
全文

冠状病毒是单链RNA病毒,能够感染人类、哺乳动物、禽类等多种宿主,引起呼吸道、消化道及神经系统损伤。2003年在中国大陆暴发流行严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV),近8 000例患者感染,其高达10%的致死率引起了人们对于人冠状病毒(human coronavirus,HCoV)的巨大关注[1,2]。2012年另一种高致病性HCoV——中东呼吸综合征冠状病毒(Middle-East Respiratory Syndrome coronavirus, MERS-CoV)的发现,进一步提示对于HCoV监测的重要性[2,3]
        在HCoV中,HCoV-OC43流行最广,检出率最高。重组是HCoV-OC43主要的进化方式之一,HCoV-OC43频繁地通过同源RNA重组产生新的基因型,仅在法国的研究中就检出了3种新的重组基因型[4]。一般而言,HCoV-OC43主要引起温和的上呼吸道感染。然而,近期研究发现,HCoV-OC43重组基因型与致死性脑炎和肺炎相关。例如,在中国香港的研究中,重组基因型D型与老年人群肺炎相关[5]。英国报道了1例患有重症联合免疫缺陷婴儿感染重组基因型E后,引起脑炎并导致死亡[6]。同时,北京也曾检出E型,检出的E型全部来自儿童下呼吸道感染病例[7]。以上研究表明,HCoV-OC43重组基因型的产生对公众的健康产生威胁。上海作为国际化大都市,病毒基因型分布易受到国内外疫情的影响,存在输入性风险,并且目前尚未有上海HCoV-OC43流行病学和分子分型的研究。为了解上海HCoV-OC43基因型分布,剖析HCoV-OC43的变异变迁规律,本研究对2009—2016年上海HCoV-OC43流行株进行了分子进化分析,为上海HCoV的防治工作提供参考数据。

对象与方法  

1.对象:  于2009年11月至2016年4月,以上海交通大学附属新华医院呼吸科、复旦大学附属第五人民医院呼吸科、上海交通大学附属瑞金医院呼吸科、同济大学附属肺科医院呼吸科、复旦大学附属儿科医院儿科、复旦大学附属华山医院感染科和上海市长宁区中心医院感染科为监测哨点,收集其间入院的急性呼吸道感染患者的临床资料和呼吸道样本,包括咽拭子、痰、鼻咽抽吸物和肺泡灌洗液,共6 059例。所有研究对象均签署了知情同意书,本研究通过了上海市公共卫生临床中心伦理委员会审核[批号:2014伦审(K017)号]。

2.核酸提取:  利用QIAcube HT Plasticware核酸自动抽提仪(德国Qiagen公司)和Cador Pathogen 96 QIAcube HT Kit核酸抽提试剂盒(德国Qiagen公司)对样本进行病毒核酸抽提,所有步骤按照说明书进行。新鲜抽提的核酸在24 h之内检测或存于-80 ℃冰箱待用。

3.HCoV检测和测序分型:  采用HCoV通用引物、一步法RT-PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]对病毒核酸进行HCoV检测,RT-PCR扩增RDRP部分基因片段(nt:15 149-15 588)。引物序列:上游引物为5'-GGTTGGGACTATCCTAAGTG-TGA-3';下游引物为5'-CCATCATCAGATAGAAT-CATCATA-3'[8]。采用25 μl反应体系:2×缓冲液12.5 μl、反转录酶2.5 U、HS Taq 2.5 U、引物5×10-12 mol、RNA模板2.5 μl。反应体系:42 ℃反转录10 min,94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共45个循环,72 ℃终末延伸10 min后,取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,PCR产物用3730xl DNA Analyzer(美国Applied Biosystems公司)一代测序仪进行测序。获得的基因序列通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对进行基因分型。样本同时检测其他呼吸道常见病原体,包括人流感病毒、人副流感病毒、小RNA病毒、人腺病毒、人呼吸道合胞病毒、人博卡病毒和人偏肺病毒。

4.HCoV-OC43刺突蛋白、依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP)和核衣壳蛋白全基因扩增:  采用特异性引物(表1)、一步法RT-PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]对刺突蛋白、RDRP、核衣壳蛋白基因进行扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

表1人冠状病毒OC43刺突蛋白、RDRP和核衣壳蛋白基因扩增引物序列、产物长度及退火温度

5.序列测定及分析:  PCR产物用3730xl DNA Analyzer(美国Applied Biosystems公司)一代测序仪进行测序,以BJ/5240/2007(GenBank accession no.KF923891)为参考,对序列进行拼接。利用BioEdit 7.1.3.0软件进行序列编辑、翻译和比对。采用MEGA 6.06软件(邻接法)对核苷酸序列进行系统进化树分析。

6.阳性选择位点分析:  利用BioEdit 7.1.3.0软件对的刺突蛋白基因序列进行比对。采用PAML软件包中的codeml软件对刺突蛋白基因进行阳性选择位点分析[9],使用贝叶斯经验检验计算预测位点的后验概率。当一个位点的非同义突变与同义突变的比值ω>1且后验概率>0.9即预测为阳性选择位点。

7.N-糖基化位点预测:  用NetNGlyc 1.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)在线预测刺突蛋白潜在的N-糖基化位点,氨基酸序列出现天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的其他氨基酸)三联子,并且软件预测的可能性阈值>0.5,此天冬酰胺则被认为是潜在的N-糖基化位点。

结果  

1.HCoV分子分型和流行特征分析:  6 059例患者中,检出63株HCoV,检出率为1.04%。其中10例患者同时检出其他呼吸道病原体,主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、小RNA病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒、人腺病毒和人呼吸道合胞病毒。63株HCoV中,62株可分型,1株由于病毒拷贝数较低未分型成功,型别分别为HCoV-OC43(34株,54.83%)、HCoV-229E HCoV-229E(18株,29.03%)和HCoV-HKU1(10株,16.13%),未检出HCoV-NL63、MERS-CoV和SARS-CoV。HCoV各基因型流行呈现季节性,详见表2。HCoV-OC43主要在夏季和秋季检出,少量样本在春季和冬季检出,而HCoV-229E主要在春季和冬季流行,夏季和秋季散发。HCoV-HKU1主要在春季和冬季流行,夏季散发,没有阳性样本在秋季检出。

表2上海2009—2016年不同季节HCoV各型别检出情况

2.HCoV-OC43亚型分析:  2009—2016年,共检出34株HCoV-OC43流行株,其中29株测序成功,获得刺突蛋白、RDRP、核衣壳蛋白全基因序列。从刺突蛋白、RDRP和核衣壳蛋白基因进化树上可见,27株与D型参考株位于同一分支,与D型参考株HK/02/2004的刺突蛋白、RDRP和核衣壳蛋白基因核苷酸同源性分别为98.4%~99.2%,99.7%~99.8%和99.4%~100%,被确定为D型;其余2株与B型参考株在同一分支上,与B型参考株Belgium/87309/2003的刺突蛋白、RDRP和核衣壳蛋白基因核苷酸同源性分别为98.9%,99.8%和99.3%~99.5%,被确认为B型。详见图1。其中,D型在研究周期中的各年份均有检出,然而2株B型仅在2015年检出。

图12009—2016年上海人冠状病毒OC43流行株刺突蛋白(图A)、依赖RNA的RNA聚合酶(图B)和核衣壳蛋白(图C)基因系统进化树

3.HCoV-OC43 D型刺突蛋白基因序列分析:  以SH/1821/2009作为基准序列,发现27株D型流行株刺突蛋白共有39个氨基酸位点变异,1个氨基酸(甘氨酸G)插入(第118~119位之间)。其中,32个氨基酸位点变异和1个氨基酸插入位于刺突蛋白1蛋白(第1~763位),7个氨基酸位点变异位于刺突蛋白2蛋白(第764~1358位)。刺突蛋白1包含N端结构域(N-terminal domain, NTD)(第15~312位)和受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)(第339~549位)两个功能域,20个氨基酸位点变异和1个氨基酸插入位于NTD,10个氨基酸位点变异位于RBD。2009—2016年,上海HCoV-OC43 D型流行株在刺突蛋白基因进化树上分成2簇,其中2009—2011年流行株(除2011年SH/3484/2011流行株)分在同一簇,2012—2016年流行株和1株2011年流行株(SH/3484/2011)分成另外一簇。将2簇流行株的刺突蛋白氨基酸序列进行比较,发现有4个主要的氨基酸位点变异,分别为S195L/Y(1039、8268、1610株为Y)、S521H、F535L和T546S,其中S195L位于NTD区,S521H、F535L、T546S位于RBD区。详见图2

图22009—2016年上海人冠状病毒OC43 D型流行株刺突蛋白氨基酸序列突变位点分析

4.HCoV-OC43 D型刺突蛋白基因阳性选择位点分析:  27株2009—2016年间上海OC43 D型流行株刺突蛋白基因阳性选择位点分析结果显示(表3),D型刺突蛋白基因平均非同义替换与同义替换的比值为0.24,总计有13个阳性选择位点,其中10个位于NTD区,3个位于RBD区。

表32009—2016年上海人冠状病毒OC43 D型流行株刺突蛋白基因阳性选择位点分析

5.HCoV-OC43 D型刺突蛋白N-糖基化预测分析:  2012—2016年HCoV-OC43 D型流行株(除去2013年D型流行株)与2009—2011年HCoV-OC43 D型流行株相比,由于刺突蛋白第22位氨基酸发生P22T突变,从而新增1个潜在的糖基化位点(第20位)。详见图2

讨论  在国内外的研究中,HCoV在呼吸道样本中的检出率为0.93%~18%[10,11,12,13,14,15,16]。在本研究中,2009—2016年上海呼吸道样本中HCoV检出率为1.04%,与中国香港、北京HCoV检出率接近[12,16],但低于英国、澳大利亚和瑞士相关报道中的检出率[10,11,13]。HCoV阳性感染者经常合并其他呼吸道病原体感染。本研究中10例HCoV阳性样本同时检出其他呼吸道病原体,这与广州、英国的相关研究一致[11,17]
        由于冠状病毒在复制过程中模板的随机转换,使得冠状病毒经常发生同源重组。重组能使病毒更好的适应宿主和产生新的基因型。D型来自B、C型重组,在中国香港的研究中,D型与肺炎相关[5]。而在本研究中,27例D型感染患者中20例为上呼吸道感染,提示D型感染与重症发病(肺炎等)并没有关联,结果与北京研究一致[7]。E型由B、C、D型重组产生。虽然在本研究中未检出E型,但是上海存在产生E型的基础基因型B型和D型,提示上海仍然存在重组产生E型的风险。
        HCoV-OC43的刺突蛋白是HCoV-OC43主要的抗原蛋白,其进化速率最快[5,7,18]。通过对27株上海D型流行株刺突蛋白序列分析发现,刺突蛋白氨基酸替换主要发生在NTD区,相比刺突蛋白其他区域,NTD区含有更多阳性选择位点,提示NTD是重要的进化变异区域,而NTD区氨基酸替换可能影响NTD区与神经氨基酸受体的结合力[19,20]。进一步比较本研究中上海D型的两个谱系发现,2011—2016年谱系与2009—2011年谱系相比,刺突蛋白有4个氨基酸的变异。在北京的研究中,Y521H在2007年出现,而随后的2008—2010年流行期中,95.45%流行株刺突蛋白第521位为H。在本研究中,2011年出现了H521S的转换,占7.14%,而随后2012—2015年100%的流行株为521S,并且在本研究中521也被预测为是阳性选择位点,进一步验证REN的推测:521位点在HCoV-OC43进化过程中可能起着重要的作用[19]
        除了氨基酸替换,HCoV-OC43的刺突蛋白基因往往发生氨基酸的插入或缺失[4]。3株2013年上海HCoV-OC43的D型流行株在刺突蛋白NTD区含有1个甘氨酸插入。2009—2016年上海27株HCoV-OC43 D型流行株与2株2004年中国香港参考株相比,在刺突蛋白基因RBD区有3个氨基酸(LNG)缺失(第503~504位之间)。详见图3。而搜索Genbank中2007—2016年HCoV-OC43 D型序列,发现均有3个氨基酸(LNG)缺失,提示近期的D型流行株在刺突蛋白RBD功能域序列已有了较大的进化,但这一进化是否导致刺突蛋白与细胞受体结合力或抗原性发生改变从而增强了D型的宿主适应性,需要进一步的实验来验证。

图32009—2016年上海人冠状病毒OC43 C和D型刺突蛋白基因受体结合结构域序列比对
N-连接型糖基化是指N-乙酰葡糖胺与多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮以共价键连接,这种修饰对蛋白免疫原性具有重要意义[21]。本研究刺突蛋白N-糖基化位点结果显示,上海2012—2016年D型流行株(除去2013年D型)与2009—2011年流行株相比,新增1个糖基化位点(第20位)。这可能在一定程度上帮助病毒逃逸宿主中和抗体识别。
        综上所述,通过对上海2009—2016年间HCoV的流行情况以及HCoV-OC43亚型的刺突蛋白变异变迁规律进行研究,发现刺突蛋白中与细胞受体结合相关的功能域发生了较大的变化。

参考文献
[1]PeirisJS, GuanY, YuenKY. Severe acute respiratory syndrome[J]. Nat Med, 2004,10(12Suppl):S88-97. DOI: 10.1038/nm1143.
[2]ObohoIK, TomczykSM, Al-AsmariAM, et al. 2014 MERS-CoV outbreak in Jeddah--a link to health care facilities[J]. N Engl J Med, 2015,372(9):846-854. DOI: 10.1056/NEJMoa1408636.
[3]赵彦杰,谭文杰.中东呼吸综合征冠状病毒基因组结构特征和分子检测[J].中华预防医学杂志,2015,(5):461-464. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2015.05.018.
[4]KinN, MiszczakF, LinW, et al. Genomic Analysis of 15 Human Coronaviruses OC43 (HCoV-OC43s) Circulating in France from 2001 to 2013 Reveals a High Intra-Specific Diversity with New Recombinant Genotypes[J]. Viruses, 2015,7(5):2358-2377. DOI: 10.3390/v7052358.
[5]LauSK, LeeP, TsangAK, et al. Molecular epidemiology of human coronavirus OC43 reveals evolution of different genotypes over time and recent emergence of a novel genotype due to natural recombination[J]. J Virol, 2011,85(21):11325-11337. DOI: 10.1128/JVI.05512-11.
[6]MorfopoulouS, BrownJR, DaviesEG, et al. Human Coronavirus OC43 Associated with Fatal Encephalitis[J]. N Engl J Med, 2016,375(5):497-498. DOI: 10.1056/NEJMc1509458.
[7]ZhangY, LiJ, XiaoY, et al. Genotype shift in human coronavirus OC43 and emergence of a novel genotype by natural recombination[J]. J Infect, 2015,70(6):641-650. DOI: 10.1016/j.jinf.2014.12.005.
[8]WooPC, LauSK, ChuCM, et al. Characterization and complete genome sequence of a novel coronavirus, coronavirus HKU1, from patients with pneumonia[J]. J Virol, 2005,79(2):884-895. DOI: 10.1128/JVI.79.2.884-895.2005.
[9]YangZ. PAML 4: phylogenetic analysis by maximum likelihood[J]. Mol Biol Evol, 2007,24(8):1586-1591. DOI: 10.1093/molbev/msm088.
[10]RegameyN, KaiserL, RoihaHL, et al. Viral etiology of acute respiratory infections with cough in infancy: a community-based birth cohort study[J]. Pediatr Infect Dis J, 2008,27(2):100-105. DOI: 10.1097/INF.0b013e31815922c8.
[11]GauntER, HardieA, ClaasEC, et al. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method[J]. J Clin Microbiol, 2010,48(8):2940-2947. DOI: 10.1128/JCM.00636-10.
[12]RenL, GonzalezR, XuJ, et al. Prevalence of human coronaviruses in adults with acute respiratory tract infections in Beijing, China[J]. J Med Virol, 2011,83(2):291-297. DOI: 10.1002/jmv.21956.
[13]MackayIM, ArdenKE, SpeicherDJ, et al. Co-circulation of four human coronaviruses (HCoVs) in Queensland children with acute respiratory tract illnesses in 2004[J]. Viruses, 2012,4(4):637-653. DOI: 10.3390/v4040637.
[14]PrillMM, IwaneMK, EdwardsKM, et al. Human coronavirus in young children hospitalized for acute respiratory illness and asymptomatic controls[J]. Pediatr Infect Dis J, 2012,31(3):235-240. DOI: 10.1097/INF.0b013e31823e07fe.
[15]Cabe?aTK, GranatoC, BelleiN. Epidemiological and clinical features of human coronavirus infections among different subsets of patients[J]. Influenza Other Respir Viruses, 2013,7(6):1040-1047. DOI: 10.1111/irv.12101.
[16]YipCC, LamCS, LukHK, et al. A six-year descriptive epidemiological study of human coronavirus infections in hospitalized patients in Hong Kong[J]. Virol Sin, 2016,31(1):41-48. DOI: 10.1007/s12250-016-3714-8.
[17]张素粉,徐霖,罗虹娇,等. 2012—2015年广州人冠状病毒及其亚型流行病学特征[J].热带医学杂志,2016,16(4):430-433.
[18]KünkelF, HerrlerG. Structural and functional analysis of the surface protein of human coronavirus OC43[J]. Virology, 1993,195(1):195-202. DOI: 10.1006/viro.1993.1360.
[19]RenL, ZhangY, LiJ, et al. Genetic drift of human coronavirus OC43 spike gene during adaptive evolution[J]. Sci Rep, 2015,5:11451. DOI: 10.1038/srep11451.
[20]PengG, XuL, LinYL, et al. Crystal structure of bovine coronavirus spike protein lectin domain[J]. J Biol Chem, 2012,287(50):41931-41938. DOI: 10.1074/jbc.M112.418210.
[21]RatnerL. Glucosidase inhibitors for treatment of HIV-1 infection[J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 1992,8(2):165-173. DOI: 10.1089/aid.1992.8.165.