中华预防医学杂志    2018年01期 云南省271株结核分枝杆菌分离株基因分型研究    PDF     文章点击量:589    
中华预防医学杂志2018年01期
中华医学会主办。
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陈连勇 杨星 茹浩浩 杨慧娟 闫双群 马利 陈金瓯 杨蕊 许琳
ChenLianyong,YangXing,RuHaohao,YangHuijuan,YanShuangqun,MaLi,ChenJin'ou,YangRui,XuLin
云南省271株结核分枝杆菌分离株基因分型研究
A study on genotype of 271 mycobacterium tuberculosis isolates in 6 prefectures in Yunnan Province
中华预防医学杂志, 2018,52(1)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.01.012

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投稿日期: 2017-03-27
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云南省271株结核分枝杆菌分离株基因分型研究
陈连勇 杨星 茹浩浩 杨慧娟 闫双群 马利 陈金瓯 杨蕊 许琳     
陈连勇 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
杨星 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
茹浩浩 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
杨慧娟 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
闫双群 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
马利 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
陈金瓯 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
杨蕊 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
许琳 650022 昆明,云南省疾病预防控制中心结核病防治所
摘要: 目的  分析云南省6州(市)结核分枝杆菌分离株的基因分型情况。方法  实验菌株来源于2014年1—12月在云南省6个州(市)疾病预防控制中心保存的结核分枝杆菌临床分离菌株,共271株。采用Spoligotyping和12个VNTR位点的多位点数目可变串联重复序列分析方法(MLVA),对上述结核病分枝杆菌分离株进行基因分型,Spoligotyping分型结果与SITVITWEB数据库进行比较确定菌株的基因家族,MLVA结果采用BioNumberics 5.0软件进行聚类分析。结果  271例结核病患者年龄为(41.9±15.1)岁,男性为196例(72.32%);其中普洱市来源的菌株数最多,共94株(34.69%)。Spoligotyping分型:271株菌可分为40个基因型,包括16个基因簇和24个独立基因型;其中北京基因型菌株为151株(55.72%),非北京基因型为120株(44.28%)。MLVA分型:分位2个基因群,包括207个基因型(30个基因簇,177个独立基因型),成簇率为23.62%;其中Ⅰ群为120株,成簇率为16.67%;Ⅱ群为151株,成簇率为29.14%。12个VNTR位点在全部MTB中的总分辨力为0.993,北京基因型和非北京基因型菌株中的总分辨力分别为0.982和0.995。结论  云南省结核分枝杆菌主要流行株仍以北京基因型为主,结核分枝杆菌基因型存在明显多态性分布,部分地区可能存在北京基因型的近期传播,应开展早期快速诊断和治疗,切断传播链,防止结核病疫情暴发。
关键词 :结核;分枝杆菌,结核;基因型
A study on genotype of 271 mycobacterium tuberculosis isolates in 6 prefectures in Yunnan Province
ChenLianyong,YangXing,RuHaohao,YangHuijuan,YanShuangqun,MaLi,ChenJin'ou,YangRui,XuLin     
Dispensary for Tuberculosis Control and Prevention, Yunnan Center for Disease Control and Prevention, Kunming 650022, China
Corresponding author: Xu Lin, Email:xulinth@hotmail.com
Abstract:Objective  To understand the characteristics of genotypes of Mycobacterium tuberculosis isolates in Yunnan province, and provide the molecular epidemiological evidence for prevention and control of tuberculosis in Yunnan Province.Methods  Mycobacterium Tuberculosis isolates were collected from 6 prefectures of Yunnan province in 2014 and their Genetypes of Mycobacterium tuberculosis isolates were obtained using spoligotyping and multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis (MLVA). The results of spoligotyping were entered into the SITVITWEB database to obtain the Spoligotyping International Type (SIT) patterns and the sublineages of MTB isolates. The genoyping patterns were clustered with BioNumerics (version 5.0).Results  A total of 271 MTB isolates represented patients were collected from six prefectures in Yunnan province. Out of these patients, 196 (72.3%) were male. The mean age of the patients was (41.9±15.1) years. The most MTB isolates were from Puer, totally 94 iusolates(34.69%). Spoligotyping analysis revealed that 151 (55.72%) MTB isolates belonged to the Beijing genotype, while the other 120 (44.28%) were from non-Beijing genotype; 40 genotypes were consisted of 24 unique genotypes and 16 clusters. The 271 isolates were differentiated into 30 clusters (2 to 17 isolates per cluster) and 177 unique genotypes, showing a clustering rate of 23.62%. Beijing genotype strains showed higher clustering rate than non-Beijing genotype strains (29.14% vs 16.67%). The HGI of 12-locus VNTR in total MTB strains, Beijing genotype strains and non-Beijing genotype was 0.993, 0.982 and 0.995 respectively.Conclusion  The Beijing genotype was the predominant genotype in Yunnan Province, the characteristics of Mycobacterium tuberculosis showed high genetic diversity. The genotyping data reflect the potential recent ongoing transmission in some area, which highlights the urgent need for early diagnosis and treatment of the infectious TB cases, to cut off the transmission and avoid a large TB outbreak.
Key words :Tuberculosis;Mycobacterium tuberculosis;Genotype
全文

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性呼吸道传染性疾病,它仍是一种世界范围内的主要公共卫生问题。根据2016年WHO报告,2015年全球新发结核病患者1 040万例,死亡例数为144万例,是全球10大死因之一[1]。特别是MTB和HIV双重感染的耐多药结核病的产生,极大增加了结核病控制的难度。尽管近年来结核病发病率和死亡率有所下降,但受到中国巨大的感染人群基数、缺乏医疗设施和其他社会条件的限制,中国的结核病控制工作任重道远。
        结核病基因分型技术在结核病流行病学方面显示了其独特的作用,利用其开展疾病暴发调查,传染源的寻找和追踪、鉴别内源性复发和近期外源性感染、耐药菌株传播和实验室交叉污染等方面的研究,解决了传统方法难以证实的问题,能够为结核病的预防、控制和治疗提供重要的参考[2,3]。研究一定区域内结核分枝杆菌的基因型分布和主要流行菌株是开展结核病分子流行病学重要的基础研究领域。本研究采用间隔区寡核苷酸基因分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)方法和多位点数目可变串联重复序列分析(multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis,MLVA)方法分别对2014年1—12月在云南省6州(市)从涂阳结核病患者分离培养到MTB进行基因分型研究,以了解云南省MTB的基因型及分布特征。

菌株与方法  

一、菌株  实验菌株来源于2014年1—12月在云南省的曲靖市、普洱市、西双版纳傣族自治州(西双版纳州)、德宏傣族景颇族自治州(德宏州)、临沧市和丽江市等6个州(市)疾病预防控制中心保存的MTB临床分离菌株,共271株,其中曲靖市49株,普洱市94株,西双版纳州40株,德宏州35株,临沧市31株,丽江市22株。所有菌株经对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鉴别培养基确定为MTB。标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

二、主要仪器和试剂  UVP BioSpectrum 410凝胶成像系统(美国UVP有限责任公司);LifeTouch PCR基因扩增仪(杭州博日科技有限公司);164-5050型电泳仪(美国伯乐Bio-Rad公司);Spoligotyping探针及引物(北京擎科新业生物技术有限公司)。结核分型鉴定试剂盒Ⅰ购自北京康为世纪生物科技有限公司(Cat.No.CW2287,含Mtb鉴定、16S rRNA、QUB-11b、QUB-18、QUB-26、QUB-4156、QUB-1895、MIRU26、MIRU31、MIRU10、MIRU40、Mtub21、Mtub04和ETR-F等组分)。

三、DNA模板制备  从固体培养基斜面上刮取少量(1接种环)培养了3~4周的新鲜实验菌株,重悬于100 μl TE缓冲液中,80 ℃灭活30 min;随后100 ℃煮沸10 min,立即置于冰上2 min,13 200 × g离心10 min后,取上清置于另一1.5 ml的无菌离心管中,-20 ℃保存备用,作为基因分型的DNA模板。

四、Spoligotyping分型  

1.PCR扩增:  用一对引物扩增整个间隔区,上下游引物均为18个核苷酸。引物的序列为DRa:5'-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3',5'端进行生物素标记;DRb: 5'-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3'。反应条件:96 ℃预变性3 min;96 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。

2.膜的制备:  用新鲜配置质量浓度为16%的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺孵育生物素C膜10 min,立即将膜置于水中清洗;在迷你转渍槽的凹槽中平行加入150 μl用500 mmol/L碳酸氢钠(pH8.4)稀释的Spoligotyping探针溶液,室温孵育1 h。将膜从迷你转渍槽中取出,并用100 mmol/L氢氧化钠孵育10 min。将膜用2倍的氯化钠-柠檬酸钠(saline sodium phosphate, SSPE)缓冲液含0.1%十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)溶液于50 ℃洗膜10 min,再用20 mmol/L乙二胺四乙酸室温孵育15 min,然后密封于塑料袋中置4 ℃保存备用。

3.PCR产物的杂交与检测:  用2倍SSPE含0.1%SDS于50 ℃洗膜5 min,将膜置迷你转渍槽中,方向与探针方向垂直。将20 μl PCR产物加到150 μl 2倍SSPE含0.1%SDS中,100 ℃加热变性10 min。将150 μl稀释的PCR产物加到凹槽中,55 ℃杂交60 min。取出膜,用2倍SSPE含0.5% SDS于55 ℃洗膜2次,每次10 min。然后用链亲和素-过氧化物酶连结液(streptavidin-peroxidase conjugate, POD)(2.5 μl POD加到10 ml 2倍SSPE含0.5% SDS中)于42 ℃孵育膜30 min。洗膜并将置于化学发光检测液中孵育1 min,曝光于X光片5 min。判读结果并按顺序录入到Excel表中。然后将其导入SITVITWEB数据库中(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE)进行比对,获得Spoligotyping分型结果等信息。

五、MLVA分析方法  按照MTB分型鉴定试剂盒Ⅰ的操作说明,先使用MTB鉴定、16S rRNA组分进行菌种鉴定,随后进行MTB的12个数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)的基因分型。12个VNTR位点扩增,PCR反应体系为20 μl,分别含19 μl PCR预混液,1 μl DNA模板。PCR反应条件为:95 ℃预变性10 min;94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,30个循环;最后72 ℃延伸7 min。取5 μl扩增产物,在1%琼脂糖(含GelRed核酸染料)凝胶上电泳(电压100 V,100~150 min),然后在凝胶成像系统下观察结果,并确定PCR产物的相对分子量大小及每个菌株各VNTR位点重复单元的重复数,重复单元数取整数,并将结果输入到Excel表中。实验中以H37Rv作为对照。

六、基因多态性与数据分析  利用BioNumberics 5.0软件将MLVA及Spoligotyping数字化分型结果进行基因分型聚类分析。成簇率=(nc-c)/n, nc指所有成簇的菌株,c代表菌株成簇数,n代表所有的菌株样本。MLVA中各VNTR位点分辨力使用分辨力指数(hunter-gaston index,HGI)表示,参照文献[4]计算。其中,其中N为菌株总数,S是所用分型方法划分的总类型数,nj是属于第j类型的菌株数。HGI小于0.3为分辨力低,0.3~0.6为分辨力中,大于0.6为分辨力高。

结果  

一、基本情况  271例结核病患者年龄为(41.9±15.1)岁,男性为196例(72.32%),女性为75例(27.67%);普洱市来源的菌株数最多(94株),占总菌株数的34.69%,其次为曲靖市(49株,18.08%)和西双版纳州(40株,14.76%)。

二、Spoligotyping分型结果  271株菌可分为40个基因型,包括16个基因簇和24个独立基因型(表1)。将本研究结果与SITVITWEB数据库进行比对后发现,33个基因型共257株(94.83%)能在数据库中找到,其余7个基因型共14株在比对数据库中不存在,为新的Spoligotyping分型结果。257株可在数据库中找到的菌株中,北京基因型和非北京基因型菌株分别为149株(57.98%,149/257)和108株(42.02%,108/257);14株数据库中不存在的菌株中,有2株根据基因家族命名规则和Spoligotyping指纹图谱判断,属于北京基因型菌株。详见表1

表12014年云南省271株MTB Spoligotyping分型结果

1.北京基因型菌株:  共151株,分为6个基因型,包括4个基因簇和2个独立基因型,其中最大基因簇共136株,为典型北京基因型菌株(1~34间隔区缺失),其余13株为非典型北京基因型菌株(35~43间隔区也有缺失)。详见表1

2.非北京基因型菌株:  120株非北京基因型菌株中,T1家族最多(39.17%,47株),其次为T3家族(29.17%,35株),其他家族(17株)占14.17%。详见表1

三、MLVA分型结果  271株菌分为2个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群),包括207个基因型(30个基因簇,177个独立基因型),成簇率为23.62%。

1.Ⅰ群:  含100个基因型(120株),其中87个为独立基因型(87株),13个为基因簇(33株),成簇率为16.67%。13个成簇的基因簇中,含菌株数最多的一簇有6株菌,均来源于临沧市的凤庆县。

2.Ⅱ群:  含107个基因型(151株,为北京基因型),其中90个为独立基因型(90株),17个为基因簇(61株),成簇率为29.14%。含菌株数最多的一个基因簇有17株(12个VNTR位点结果为6、3、8、2、4、8、5、3、3、8、4、2),均来自曲靖市,其中13株来源于曲靖市的麒麟区,4株来源于曲靖市的宣威市;含菌株数第二多的一个基因簇有8株(12个VNTR位点结果为2、10、9、4、4、8、5、3、3、5、4、2),均来源于普洱市的孟连县。

四、HGI情况  12个VNTR位点在全部MTB中的总HGI为0.993,在北京基因型和非北京基因型菌株中的总HGI分别为0.982和0.995。其中8个VNTR位点,即QUB-11b、QUB18、MTRU26、QUB26、Mtub21、Mtub04、ETR-F和MIRU31,在全部MTB中显示出较高的分辨力。Mtub21、Mtub04、QUB-4156和MIRU40对北京基因型和非北京基因型菌株的分辨力不同,其中Mtub21和QUB-4156对北京基因型的分辨力较高,HGI分别为0.705和0.624,对非北京基因型显示中等分辨力和低分辨力,HGI分别为0.468和0.227;Mtub04和MIRU40对非北京基因型菌株显示较高分辨力,HGI分别为0.603和0.638,对北京基因型显示中等和较低分辨力,HGI分别为0.397和0.243。详见表2

表212个VNTR位点在北京基因型及非北京基因型菌株中的分辨力指数

讨论  北京基因型是指一类具有相似遗传背景的菌株。1995年van Soolingen等[5]对源于北京地区的一组MTB进行基因分型研究时发现并命名。在我国,北京基因型分布总体表现为北方明显高于南方[6]。本研究对来自于云南省以汉族居住为主的曲靖市和边境少数民族聚集较多的6个州、市的MTB进行基因分型,结果显示北京基因型占55.72%,与陈连勇等[7]研究结果基本一致,但低于全国平均水平(75%)[8,9],也低于黑龙江(86.4%)、北京(82%)、河南(89.8%)等地区[7,8,9,10,11,12,13],与四川(51.9%)、广西(61.9%)、福建(57.3%)结果相近[6,8,9,14]。表明北京基因型是云南省的主要流行株,但非北京基因型占了一个较大的比重,MTB基因型具有明显的多态性分布。这与云南独特的地理位置、立体气候和多民族分布等有关。
        在非北京基因型中,与国内其他省份相比,T3家族所占比例很高。在本研究中,除了发现7个新的未命名的基因型外,还发现1株X2家族。X家族基因型流行于英国、美国、澳大利亚、南非和加勒比海等地区[4,15],在国内研究中仅见Li等[16]有1株X1家族的报道,本研究中出现1株X2家族为国内首次发现。而与云南接壤的缅甸、越南有X家族的报道[17,18]
        目前,MTB基因分型技术主要有基于插入序列IS6110的限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP)方法、Spoligotyping和MLVA分型技术。IS6110-FRLP因技术复杂、实验结果不便于实验室间比对等原因而影响了该方法的普及[2]。Spoligotyping操作简单,快速,并建立了国际上的Spoligotyping基因分型数据库,提供MTB家族谱系背景,可作为鉴定北京基因型的金标准[19,20]。但该方法分辨力低,不能将北京基因型菌株进一步区分;MLVA方法操作简便、易于数字化和分辨力高,便于不同实验室结果比较,特别适用于北京基因型较高的地区[2]。因此,联合应用Spoligotyping和MLVA可更好地用于结核病分子流行病学调查[20]。本研究结果发现北京基因型菌株成簇率高,且最大的2个基因簇均来自于北京基因型,这在一定程度上反映北京基因型菌株可能具有更强的毒力和传播能力,这与Yang等[9]的研究结果一致。这两个基因簇中,一簇有17株菌,均来自于曲靖市,另一簇来源于普洱市。这说明曲靖市及普洱市存在MTB近期传播的可能性。MLVA方法随着选择VNTR位点的数目增加,虽然其分辨力有所提高,但工作量和实验成本也会增加,因此应采用适合本地区的优化的VNTR位点组合用于本地区的结核分子流行病学研究。本研究采用了具有较高分辨力的12个VNTR位点组合[21]进行分析,结果显示其对云南省的MTB菌株有很高的分辨能力。当然,由于本研究的菌株仅来自于云南省的6个州(市),样本量也较小,尚不能代表云南省的整体情况。在本研究中,部分位点对北京基因型和非北京基因型分辨力存在明显差异,其中Mtub04和MIRU40对非北京基因型菌株有较高的分辨力,而Mtub21和QUB-4156对北京基因型显示出较高的分辨力,这与Luo等[21]的结果基本一致。这可能与地域、人群及菌株差异有关。
        综上所述,云南省MTB主要流行株仍以北京基因型为主,MTB基因型存在明显多态性分布,部分地区存在MTB近期传播的可能性,应开展早期快速诊断和治疗,切断传播链,防止结核病疫情暴发。

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