中华预防医学杂志    2018年02期 河南省4家大型屠宰场中预冷后肉鸡胴体沙门菌污染水平及耐药状况分析    PDF     文章点击量:668    
中华预防医学杂志2018年02期
中华医学会主办。
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白莉 李薇薇 韩海红 刘继开 付萍 张秀丽 郭云昌
BaiLi,LiWeiwei,HanHaihong,LiuJikai,FuPing,ZhangXiuli,GuoYunchang
河南省4家大型屠宰场中预冷后肉鸡胴体沙门菌污染水平及耐药状况分析
Surveillance of contamination level and antimicrobial resistance analysis of Salmonella on broiler carcasses after chilling in 4 poultry slaughterhouses of Henan Province
中华预防医学杂志, 2018,52(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.02.002

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投稿日期: 2017-07-27
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河南省4家大型屠宰场中预冷后肉鸡胴体沙门菌污染水平及耐药状况分析
白莉 李薇薇 韩海红 刘继开 付萍 张秀丽 郭云昌     
白莉 100021 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测二室卫生部食品安全风险评估重点实验室
李薇薇 100021 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测二室卫生部食品安全风险评估重点实验室
韩海红 100021 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测二室卫生部食品安全风险评估重点实验室
刘继开 100021 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测二室卫生部食品安全风险评估重点实验室
付萍 100021 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测二室卫生部食品安全风险评估重点实验室
张秀丽 河南省疾病预防控制中心微生物检验室
郭云昌 100021 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测二室卫生部食品安全风险评估重点实验室
摘要: 目的  分析河南省4家大型屠宰场中预冷后肉鸡胴体沙门菌污染水平及耐药状况。方法  以河南省4家屠宰量为15 000~50 000羽/日的大型屠宰场为采样点,共采集269份预冷后肉鸡胴体进行沙门菌污染检测,对样品中沙门菌进行检测和分离,采用微量半同体氯化镁孔雀绿最可能数(MPN)法对样品中沙门菌进行定量检验,采用微量肉汤稀释法测定分离株对8种抗生素的最低抑菌浓度(MIC),并进行药敏试验。结果  共分离出沙门菌131株,污染率为48.7%,平均污染水平为1.32 MPN/g。131株沙门菌共检出8种血清型,其中肠炎沙门菌最多,为93株(71.0%),其次为印第安纳沙门菌21株(16.0%)。只有2株肠炎沙门菌(1.5%)对所有测试的抗生素敏感,其余129菌株对8种抗生素均有不同程度的耐药,其中对奈啶酸(NAL)的耐药率最高,为79.4%(104株),多重耐药菌株为51株(38.9%)。结论  河南省4家大型屠宰场中预冷后肉鸡胴体沙门菌污染率较高,污染水平较为严重,血清型复杂。
关键词 :沙门菌感染;抗药性;耐药分析;屠宰场
Surveillance of contamination level and antimicrobial resistance analysis of Salmonella on broiler carcasses after chilling in 4 poultry slaughterhouses of Henan Province
BaiLi,LiWeiwei,HanHaihong,LiuJikai,FuPing,ZhangXiuli,GuoYunchang     
Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment of Health, China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100021, China
Corresponding author: Guo Yunchang, Email: gych@cfsa.net.cn
Abstract:Objective  Tests were carried out for obtaining contamination level and antimicrobial resistance of Salmonella on broiler carcasses after chilling in four poultry slaughterhouses in Henan.Methods  Totally, two hundred sixty nine broiler carcasses after chilling were collected in four slaughterhouses with the daily slaughter amount around 15 000 to 50 000. For qualitative analysis of Salmonella EFSA method was used and for quantitative analysis of Salmonella modified Rappaport-Vassiliadis most probable number (MSRV-MPN) method was used. All of the isolates were subjected to antimicrobial susceptibility testing of 8 antibiotics by minimum inhibitory concentration (MIC).Results  Overall, 48.7% (131/269) of the broiler carcasses after chilling were contaminated by Salmonella, and the average of contamination level is 1.32 most probable number MPN/g. Eight serotypes were detected. The dominant serotype is Salmonella enteritidis (93, 71.0%) followed by Salmonella Indiana (21, 16.0%). Only 2 (1.5%) Salmonella enteritidis strains were sensitive to all the tested antibiotics and the remaining 129 isolates were resistant to at least one kind of eight class antibiotics. Among them, resistant to NAL was the common (104, 79.4%) and 51 (38.9%) Salmonella isolates were multidrug-resistant.Conclusion  The contamination rate and multiple antimicrobial resistant of Salmonella on broiler carcasses after chilling from slaughterhouses was very serious, while the isolates contained various serotypes.
Key words :Salmonella infections;Drug resistance;Antimicrobial resistance analysis;Slaughterhouses
全文

沙门菌病是全球重要的食源性疾病,并造成巨大的疾病负担[1]。流行病学调查资料显示,肉鸡污染沙门菌通过食物链感染人类是目前引起沙门菌病最重要原因[1]。目前世界禽类产品约占肉制品消费总量的35%,仅次于猪肉产品,生鸡肉也已成为世界贸易最重要的组成部分[2]。我国的肉鸡生产量、消费量最近几年一直处于世界前三位,2011年产量已达到1.3千万吨[2],如此高的消费量使得人们更加关注其安全性。然而肉鸡从农场到餐桌,各个环节都存在微生物污染的可能性,其中肉鸡屠宰加工过程是产品交叉污染的一个重要环节[3]。在屠宰场加工过程中,肉鸡胴体可能被粪便、消化道内容物等产生的腐生菌和致病菌的污染;除此之外,加工过程中的设施结构、工具、人员的接触以及胴体与胴体间的交叉污染都是造成肉鸡酮体被微生物污染的源头。因此加工企业应开展屠宰加工过程中微生物分析,以满足监测和控制生产加工过程中的卫生状况,并有助于危险分析与关键控制点(hazard analysis and critical control points,HACCP)的确定和改进[4,5]。预冷后肉鸡胴体沙门菌污染状况是评价肉鸡屠宰场控制交叉污染的一个重要指标[6]。本调查参考欧盟食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)开展肉鸡屠宰场沙门菌基线调查的方法对河南省肉鸡屠宰场加工过程中预冷后肉鸡胴体进行检测,以了解肉鸡屠宰过程中沙门菌的污染水平和耐药状况。

材料与方法  

一、材料  

1.样品来源:  2012年2—11月,以河南省4家屠宰量为15 000~50 000羽/日的大型屠宰场为采样点,共采集预冷后肉鸡胴体269份,4个屠宰场分别采样72、72、54和71份。

2.菌株来源:  沙门菌质控菌株为鼠伤寒沙门菌CMCC 50333,药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯ATCC 700603,均保存于国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室。

3.仪器与试剂:  (1)仪器:生物安全柜(型号AC2-4S1,新加坡ESCO BIOTECH公司),恒温培养箱(型号Incucell 222,德国MMM公司)、基因扩增仪(型号Tetrad 2,美国BIO-RAD公司)、电泳仪(PowerPac Basic,美国BIO-RAD公司)、凝胶成像仪(UNIVERSAL HOOD Ⅱ,美国BIO-RAD公司)。(2)试剂:半同体氯化镁孔雀绿培养基(modified semisolid Rappaport-Vassiliadis, MSRV)、磺胺煌绿增菌液,购自美国BD公司;脑心浸液琼脂、营养肉汤、四硫磺酸钠煌绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液,购自北京陆桥生物技术有限公司;头孢磺啶、沙门菌C8酯酶底物,购自青岛海博生物有限公司;沙门菌显色培养基购自法国科玛嘉公司。沙门菌O血清和H血清购于丹麦血清研究所。API 20E生化鉴定试剂条(REF 20100,法国bioMérieux公司)。

二、方法  

1.样品采集:  无菌采集预冷池预冷后的肉鸡胴体,放于无菌Stomacher 3500?塑料袋中,密封后编号并记录样品相关信息,冷藏(置于有冰块或冰袋的容器内)条件下运送到实验室,从采样到实验的间隔时间不超过2 h。

2.样品分离鉴定及定量分析:  参考EFSA开展肉鸡屠宰场沙门菌基线调查中的分离和定量方法[7],以无菌操作,剪取预冷后肉鸡胴体颈部周围组织样品25 g,加入到225 ml灭菌缓冲蛋白胨水中,均质1~2 min,制成1:10的样品稀释液。定量检验采用微量半同体氯化镁孔雀绿最可能数(mini-MSRV most probable number,MPN)方法,分别从9管培养液中取20 μl加入到MSRV板对应孔的左边,尽量接近培养基,不要戳破,不要沿管壁加。将MSRV板放在(42±1)℃培养24 h后观察结果。MSRV板孔内培养基变红且有蔓延生长的为可疑阳性孔,并完成鉴定为沙门菌,检测结果以MPN/g表示。将确认为沙门菌的典型菌落接种于LB平板,(37±1)℃培养24 h后,用无菌棉签将菌落转于甘油-脑心浸液(40%/60%)肉汤中,-70 ℃保存备用。

3.沙门菌污染水平评估:  参考EFSA开展肉鸡屠宰场沙门菌基线调查中使用MINI-MSRV MPN法对预冷后鸡肉胴体中沙门菌污染水平进行评估[4]。计算MPN网站为:http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/index.html。

4.沙门菌血清分型:  按照《食品安全国家标准》(GB 4789.4-2010)中沙门菌血清学鉴定的程序和沙门菌属抗原表对沙门菌分离株的O抗原和H抗原分别进行血清学鉴定和血清型判定,其中H抗原的位相变异试验采取简易平板法。

5.药敏试验:  将待检菌从-70 ℃冻存管接种于脑心浸液琼脂平板上(37±1)℃培养20~24 h,后转接至脑心浸液琼脂平板上(37±1)℃培养18~20 h,挑取新鲜纯培养菌落调制菌悬液(麦氏浊度0.50~0.63之间)。按照美国临床和实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的微量肉汤稀释法,对分离株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)进行测定。测试抗生素包括庆大霉素(gentamicin, GEN)、氯霉素(chloramphenicol, CHL)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、萘啶酸(nalidixate sodium, NAL)、氨苄西林(ampicillin, AMP)、四环素(tetracycline, TET)、亚胺培南(imipenem, IMP)、头孢噻肟(cefotaxime, CTX)、甲氧苄啶/磺胺甲唑(trimethoprim-Sulfamethoxazole, SXT)、替加环素(tigecycline, TGE)。药敏结果判断标准依据CLSI制定的《抗微生物药物敏感性执行标准第22版信息增刊》。

6.统计学分析:  采用SPSS 18.0软件进行统计学描述分析。沙门菌污染水平不符合正态分布,采用最大值、最小值,以及P10P50P90表示,但为了与国内外其他研究进行统一比较,同时采用±s表示。

结果  

一、预冷后肉鸡胴体沙门菌污染水平  269份整鸡样品中,131份检出沙门菌,沙门菌污染率为48.7%。阳性样品中,沙门菌污染水平为0.30~29.0 MPN/g不等,平均污染水平为1.32 MPN/g,P10P50P90分别为0.30、0.30和2.30 MPN/g,其中有5份样品(3.8%)的沙门菌污染量大于10 MPN/g。4个屠宰场样品中沙门菌污染率分别为87.5%(63份)、51.4%(37份)、13.0%(7份)和33.8%(24份);阳性样品沙门菌平均带菌量分别为1.89、0.34、0.91和1.41 MPN/g。不同屠宰场阳性样品污染率P10P50较接近。详见表1

表1河南省4家大型屠宰场中肉鸡胴体沙门菌污染率及污染水平

二、沙门菌分离株的血清分型结果  131株沙门菌分离株共分为8个不同的血清型。肠炎沙门菌最多,为93株(71.0%),其次为印第安纳沙门菌21株(16.0%)。详见表2

表2河南省4家大型屠宰场中检出的沙门菌分离株血清型情况

三、沙门菌分离株的药敏结果  131株分离株中,只有2株肠炎沙门菌(1.5%)对所有测试的抗生素敏感,其余129菌株对8种抗生素均有不同程度的耐药,其中对NAL耐药的耐药率最高为79.4%(104株),对其他抗生素的耐药率由高到低依次是AMP 61.8%(81株)、TET 38.2%(50株)、CHL 23.7%(31株)、CTX 22.9%(30株)、CIP 20.6%(27株)、SXT 19.1%(25株)、GEN 15.3%(20株)。详见表3。同时对CIP和CTX耐药的分离株为21株(16.0%),血清型均为印第安纳沙门菌。129株耐药株共有23种耐药谱,其中,最常见的3种耐药谱分别是NAL(37株)、AMP-NAL-TET(11株)、AMP-NAL(11株)。多重耐药菌株为51株(38.9%),1株印第安纳沙门菌分离株最多对8种抗生素耐药,耐药谱为AMP-CHL-CIP-CTX-GEN-NAL-TET-SXT。

表3河南省4家大型屠宰场中检出的沙门菌分离株耐药情况

讨论  本研究结果显示,48.7%屠宰场预冷后肉鸡胴体检出沙门菌。这一结果高于欧盟开展肉鸡胴体沙门菌污染率(15.6%)[4]。各个屠宰场的污染率有差异,这一结果与欧盟开展调查结果一致[4],说明不同屠宰场执行HACCP存在差异。沙门菌污染水平为0.30~29.0 MPN/g不等,平均污染水平为1.32 MPN/g,与欧盟监测结果相近[7],但明显高于2007年美国农业部食品安全监督服务局开展的肉鸡胴体调查的沙门菌污染水平(0.14 CFU/ml)[5]。不同的屠宰场肉鸡胴体沙门菌污染率和污染水平不同,推测可能与内脏去除时污染和预冷池有机氯的浓度相关[7]
        从分离菌株的血清分型结果来看,本研究中共分为8个不同血清型,优势血清型为肠炎沙门菌(71.0%)和印第安纳沙门菌(16.0%),肠炎沙门菌是引起我国食源性疾病的常见血清型,印第安纳沙门菌引起的食源性疾病较为少见,但其报道数也逐渐增加[8]。欧盟屠宰场预冷后肉鸡胴体沙门菌的主要血清型是婴儿沙门菌(29.2%)、肠炎沙门菌(13.6%)[4],韩国开展一项调查中优势血清型也为婴儿沙门菌(29.6%)和肠炎沙门菌(27.9%)[9]。我国的优势血清型与欧盟和韩国有明显差异,这可能与来源有关,在我国肉鸡孵育、养殖环境下,肠炎沙门菌和印第安纳沙门菌可能为优势菌也提示我们应加强沙门菌污染的源头控制。
        从耐药情况来看,本研究中沙门菌分离株的耐药情况较为严重,耐药率为98.5%,对NAL的耐药率高达79.4%。对目前临床治疗沙门菌的一线药物CIP和CTX的耐药率也分别达22.9%和20.6%,而对两种抗生素同时耐药的分离株有21株,高达16.0%。尽管大多数的沙门菌感染病例不需要抗生素的治疗,但对于免疫能力低下的人群,特别是儿童和老年人,侵袭性的感染可能会导致生命危险,因此需要抗生素治疗[9]。由于此类抗生素在动物养殖业中的广泛应用,在世界范围内已经出现了氟喹诺酮类抗生素或三代头孢类耐药沙门菌,耐药菌株作为耐药基因重要的储存库,通过中间载体的动物源性食品,可将耐药菌株传播至人体内,对社区人群的健康造成巨大威胁[9,10,11,12,13]。同时对CIP和CTX耐药的沙门菌血清型均为印第安纳沙门菌,在我们开展前期养殖环节的调查中,也发现了此类菌株[13,14],提示可能在孵育、养殖过程中抗生素的选择压力下,这类菌株较其他血清型的菌株,更易发生突变或接合可移动的耐药质粒而获得耐药表型,导致禽类携带的此类沙门菌株大量出现和繁殖,这也是下一步研究和防控的重点。目前在我国河南地区的腹泻患者中已分离到了此类型菌株[9],对公共卫生也产生巨大压力[13,14,15]
        预冷后肉鸡胴体沙门菌污染状况是评价肉鸡屠宰场控制交叉污染的一个重要指标。本文使用该指标进行调查研究,发现与国外相比,我国肉鸡屠宰过程中沙门菌的污染水平和分离株的耐药状况都较国外严重。FSIS通过制定并实施HACCP程序以控制和降低致病菌污染,并显著降低了肉鸡胴体沙门菌污染率[5]。我国需要借鉴和加强此方面的法律法规和预防控制措施的制定和实施。

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