中华预防医学杂志    2018年02期 一起丁酸梭菌致新生儿坏死性小肠结肠炎暴发事件的实验室诊断与溯源    PDF     文章点击量:643    
中华预防医学杂志2018年02期
中华医学会主办。
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李颖 董银苹 张迪 李凤琴
LiYing,DongYinping,ZhangDi,LiFengqin
一起丁酸梭菌致新生儿坏死性小肠结肠炎暴发事件的实验室诊断与溯源
Laboratory-based characterization and traceability of an outbreak of necrotising enterocolitis
中华预防医学杂志, 2018,52(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.02.003

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投稿日期: 2017-08-22
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一起丁酸梭菌致新生儿坏死性小肠结肠炎暴发事件的实验室诊断与溯源
李颖 董银苹 张迪 李凤琴     
李颖 100020 北京,首都儿科研究所附属儿童医院
董银苹 国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室
张迪 100020 北京,首都儿科研究所附属儿童医院
李凤琴 国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室
摘要: 目的  对一起新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)暴发事件进行实验室确证诊断与溯源。方法  2016年10—11月,以我国山东省某妇幼保健院新生儿病房同一病区3例以便血为主要表现的NEC患儿为研究对象,采集其粪便、进食乳粉、母乳及其所住病房内环境和使用的新生儿护理用品等样品,共37份,进行梭状芽胞杆菌分离鉴定;对病房进行彻底消毒后再次采集同类样品进行检测,共24份;对分离的菌株进行PFGE溯源分析。结果  NEC暴发期间采集的37份样品中,17份(46%)被梭状芽孢杆菌污染,其中15份样品检出丁酸梭菌,包括10份样品仅检出丁酸梭菌,5份样品既检出丁酸梭菌又检出生胞梭菌,其余2份样品仅检出生胞梭菌。在医务人员手涂抹、病房仪器设备表面涂抹、患儿进食的奶粉样品中只检出丁酸梭菌;母乳样品和母乳保鲜袋内壁涂抹样品仅检出生胞梭菌;母乳盒内壁、储藏母乳的冰箱、患儿所用暖箱表面涂抹样品和患儿粪便中不仅检出丁酸梭菌,还同时检出生胞梭菌。15株丁酸梭菌和7株生胞梭菌菌株的PFGE分型显示,15株丁酸梭菌和7株生胞梭菌均分别呈同一PFGE型。对病房彻底消毒后未再出现新发NEC病例,消毒后采集的所有样品中均未检测到任何梭状芽孢杆菌。结论  本次NEC暴发与院内感染丁酸梭菌密切相关。
关键词 :小肠结肠炎,坏死性;疾病暴发流行;院内感染;丁酸梭菌
Laboratory-based characterization and traceability of an outbreak of necrotising enterocolitis
LiYing,DongYinping,ZhangDi,LiFengqin     
Children's Hospital Affiliated to Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China
Corresponding author: Li Fengqin, Email: lifengqin@cfsa.net.cn
Abstract:Objective  Laboratory-based characterization and traceability were performed on an outbreak of necrotising enterocolitis (NEC) happened in a maternal and child health care hospital in China.Methods  Thirty-seven samples were collected from 3 NEC cases, that the clinical manifestations was bloody stools. Clostridium spp. isolation and identification were carried out on stool, breast milk, milk-based infant powder and environmental swab samples collected during NEC outbreak from October to November in 2016. Meanwhile, twenty-four swabs samples from ward environmental, staffs' hand as well as articles for neonates daily use were also collected and tested for Clostridium spp. after disinfection following outbreak. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis was performed on all Clostridium strains obtained.Results  46% (17/37) samples were positive for a presumptive Clostridium spp. during the outbreak of NEC. One type of Clostridium spp. isolates was cultured from 10 samples including the hands of medical staffs, some medical equipments in the ward and milk-based infant powder ingested by the case, it was identified as C.butyricum. Another type of Clostridium spp. isolates was cultured from 2 samples including breast milk and inner wall of breast milk fresh-keeping bag, it was identified as C.sporogens. Both of these two types isolates were cultured from 5 samples including inner wall of breast milk box, inner wall of refrigerator, the handle of case's incubator and the case's stool. PFGE analysis showed that all 15 strains of C. butyricum and 7 strains of C.sporogens isolated from the samples mentioned above produced indistinguishable pulsotypes respectively. No NEC cases were found after disinfection following the outbreak and all samples collected after outbreak were negative for Clostridium spp.Conclusion  The outbreak of NEC was highly related to C. butyricum contamination within the hospital.
Key words :Enterocolitis, necrotizing;Pandemics;Nosocomial infection;Clostridium butyricum
全文

新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotising enterocolitis,NEC)是一种发病率和死亡率极高、严重危害新生儿健康的消化道急症,病死率可达30%。临床表现以腹胀、消化道出血、肠黏膜溃疡坏死、门静脉积气、肠壁囊样积气症等为主[1]。目前NEC的病因尚未完全明确,其中早产、感染、缺氧、药物等为发病的主要危险因素[2]。研究显示,NEC的发生与丁酸梭菌感染高度相关。丁酸梭菌是一种严格厌氧产芽孢的杆菌,因其能产生高浓度的丁酸而得名,是一种人和动物肠道中常见的共生细菌,该菌由Prazmowski于1880年从猪肠道中首次分离获得,此后又从环境、人肠道中分离到。在亚洲一些国家,丁酸梭菌被用作益生菌在临床使用[3],但该菌株有引起婴儿肉毒中毒和NEC的风险。1977年,Howard等[4]首次报道丁酸梭菌可引发NEC。对从NEC患者生物样品中分离的丁酸梭菌菌株全基因组测序结果显示,其序列中携带编码毒素类似蛋白的基因,且该毒素类似蛋白显示出较强的细胞毒性。
        2016年10—11月,我国山东省某妇幼保健院短时间内发生多例NEC病例。为探讨此次NEC事件暴发的原因,为NEC的临床救治和处置提供依据,本研究对该起NEC暴发事件进行了流行病学调查,并在暴发期间采集相关样品进行实验室检验及溯源分析。

样品与方法  

一、样品  

1.病例情况:  2016年10—11月,我国山东省某妇幼保健院新生儿病房同一病区1个月内陆续出现15例以便血为主要表现的NEC患儿,其中5例为在本院出生的早产儿,出生后即收入该病房,出生4~6 d开始出现便血症状。另10例为外院出生的足月儿,由于溶血、肺炎等疾病收入该病房治疗,原发病治愈出院后不久又出现便血,随后以NEC再次收入同病区治疗。上述患儿均表现为血便或血丝便,伴有腹胀,在出现便血之前均为母乳或配方奶粉喂养,发病后经禁食、补液及止血治疗后病情好转,无并发症出现。由于便血病例集中出现,医院组织相关专家会诊,怀疑存在院内感染的可能,遂进行采样并送实验室检测。由于疾病暴发采样时,部分患儿已治愈出院,因此本次研究采集的患儿样品中仅包含采样期间仍在该院接受治疗的3例患儿的相关样品。上述所有样品均取得患儿父母同意后再进行采集。

2.样品采集:  (1)消毒前:共采集NEC暴发期间(2016年11月)样品37份,包括患儿A相关样品6份(粪便样品1份、母乳样品1份、患儿进食的奶粉样品1份、母乳保鲜袋内壁涂抹样品1份、患儿用暖箱内壁及把手涂抹样品各1份)、患儿B相关样品2份(粪便样品1份、患儿进食的奶粉样品1份)、患儿C相关样品2份(患儿进食的母乳样品2份)、病房内环境涂抹样品12份(非NEC患儿使用的暖箱内壁涂抹样品4份、病房用冰箱内壁涂抹样品1份、配奶桌表面涂抹样品1份、治疗桌表面涂抹样品1份、心电监护仪表面涂抹样品1份、输液泵表面涂抹样品1份、听诊器表面涂抹样品1份、电话表面涂抹样品1份、辐射台探头挡板表面涂抹样品1份)、医护人员双手表面涂抹样品8份、院内统一配备的新生儿护理用品7份(母乳盒内壁涂抹样品1份、奶瓶内壁涂抹样品2份、奶嘴表面涂抹样品2份、奶瓶盖内外壁涂抹样品1份、配奶水样品1份)。(2)消毒后:上述样品采集后,在冷藏条件下送至实验室进行检测,医院根据检测结果,立即对病房环境及所有患儿接触物品表面进行消毒,消毒后再次采集同一类别样品24份,其中医院病房内环境涂抹样品14份(NEC患儿用暖箱内壁涂抹样品2份、病房用冰箱内壁涂抹样品1份、心电监护仪表面涂抹样品1份、输液泵表面涂抹样品1份、辐射台探头挡板表面涂抹样品1份、水槽表面涂抹样品1份、止血带盒内壁涂抹样品1份、平稳区电话表面涂抹样品1份、重症区电话表面涂抹样品1份、平稳区电脑键盘表面涂抹样品1份、重症区电脑键盘表面涂抹样品1份、平稳区电脑鼠标表面涂抹样品1份、重症区电脑鼠标表面涂抹样品1份)、医护人员双手表面涂抹样品2份、院内统一配备的新生儿护理用品5份(奶瓶柜内壁涂抹样品1份、母乳盒内壁涂抹样品1份、奶瓶内壁涂抹样品1份、奶嘴表面涂抹样品1份、配奶水样品1份)、同病房非NEC患儿食用的母乳样品1份、奶粉样品2份。样品采集后密封编号,低温条件下运送至实验室立即检测。

二、仪器与试剂  

1.仪器:  恒温培养箱购自德国MMM Incucell公司;生物安全柜购自美国Labconco公司;VITEK2 Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统、厌氧培养装置购自法国梅里埃公司;CHEF DRII system、凝胶成像系统及普通PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

2.试剂:  庖肉肉汤(cooked meat medium,CMM)培养基、胰酪胨蛋白胨葡萄糖酵母提取物(trypticase-peptone-glucose-yeast extract,TPGY)肉汤培养基购自北京陆桥技术责任有限公司;哥伦比亚血琼脂平板、革兰染液、API 20 A厌氧菌鉴定系统、VITEK2 ANC TEST KIT购自法国梅里埃公司;DNA提取试剂盒、2×Pfu PCR MasterMix购自天根生化科技有限公司;明胶购自美国Sigma公司。

3.溶液配制:  取明胶2 g和磷酸氢二钠4 g于1 000 ml蒸馏水中,加热并充分溶解后,调pH至6.2,121 ℃高压灭菌15 min,配制成明胶磷酸盐缓冲液(gelatin phosphate buffer,GBS)备用。

三、方法  

1.样品采集:  样品采集后密封编号,按类别存放,并于冷藏(2~8 ℃)条件下运送到实验室。

2.检样处理:  参考文献[5,6]报道方法进行样品制备和分析。对固体及半固体样品,无菌取出10 g于无菌均质袋中,加入15 ml GBS,充分混匀后取2 ml样品稀释液,分别接种于10 ml CMM及10 ml TPGY增菌肉汤培养基内;涂抹样品和液体样品经充分混匀后直接取2 ml分别接种于10 ml CMM及10 ml TPGY增菌肉汤培养基内。上述接种样液后的CMM及TPGY增菌肉汤培养基分别于(35±1)℃和(28±1)℃条件下厌氧培养5 d,每个样品每种培养基接种两个平行管。

3.梭状芽孢杆菌的分离及鉴定:  分别取培养后的CMM及TPGY增菌液1 ml于5 ml离心管内,加入等体积的无水乙醇,充分混匀并室温静置1 h后用接种环取一环,划线接种于哥伦比亚血琼脂平板培养基,于(35±1)℃厌氧培养48 h,挑取可疑菌落分别进行革兰染色镜检、API 20A和VITEK2生化鉴定,同时进行16SrRNA基因克隆测序[7]

4.梭状芽孢杆菌的分子溯源分析:  取分离纯化并鉴定后的梭状芽胞杆菌,转种于哥伦比亚血琼脂平板培养基,于(35±1)℃厌氧培养48 h;取单菌落接种于10 ml CMM肉汤培养基内,于(35±1)℃厌氧培养16~18 h后,按照文献[8]报道方法进行PFGE分子分型分析。

结果  

一、菌株分离及鉴定结果  

1.消毒前:  NEC暴发期间采集的37份样品中,17份(46%)被梭状芽孢杆菌污染,其中15份样品检出丁酸梭菌,包括10份样品仅检出丁酸梭菌,5份样品既检出丁酸梭菌又检出生胞梭菌,其余2份样品仅检出生胞梭菌。在医务人员手涂抹、病房仪器设备表面涂抹(包括心电监护仪、输液泵、听诊器、电话、患儿暖箱内壁等)、患儿进食的奶粉样品中只检出丁酸梭菌;母乳样品和母乳保鲜袋内壁涂抹样品仅检出生胞梭菌;母乳盒内壁、储藏母乳的冰箱、患儿所用暖箱表面涂抹样品和患儿粪便中不仅检出丁酸梭菌,还同时检出生胞梭菌。详见表1

表1山东省某医院NEC暴发期间相关样品中丁酸梭菌与生胞梭菌分离鉴定结果

2.消毒后:  24份消毒后采集的样品中,所有样品均未检出任何梭状芽孢杆菌,消毒后该院也未再出现新的NEC病例。

二、梭状芽孢杆菌的PFGE分子分型结果  将分离到的15株丁酸梭菌和7株生胞梭菌菌株分别进行PFGE分型显示,分离自不同来源样品(患儿相关样品、病房设备表面涂抹样品、医护人员手涂抹样品、新生儿护理用品)中的15株丁酸梭菌呈同一PFGE型。同样,分离自不同来源样品(患儿相关样品、病房设备表面涂抹样品、新生儿护理用品)的7株生胞梭菌也呈同一PFGE型。详见图1

图1山东省某医院NEC暴发期间分离的15株丁酸梭菌和7株生胞梭菌PFGE聚类分析图

讨论  近年来,国外越来越多的实验证实,NEC的发生与丁酸梭菌感染有关。Peng等[9]的研究表明,丁酸梭菌产生的丁酸浓度不同,对肠道的作用各异。低浓度的丁酸(2 mmol/L)可增加肠黏膜上皮细胞的跨膜电阻,降低肠黏膜的通透性,增强肠黏膜的屏障功能;而高浓度丁酸(8 mmol/L)则降低肠黏膜上皮细胞的跨膜电阻,显著增加肠黏膜的通透性,同时可诱导细胞的凋亡坏死,并呈现出正的剂量反应关系,因此认为肠腔内短链脂肪酸的蓄积在NEC发病中发挥重要的作用。Azcarate-Peril等[1]用仔猪构建的NEC模型中,证明了丁酸梭菌与NEC的发生显著相关。分子水平的研究也证实,自NEC患者体内分离的丁酸梭菌可编码一种多肽,这种多肽与引起猪痢疾的溶血素十分相似[10,11]。并且动物实验中已经复制出丁酸梭菌致NEC样肠道损伤模型[12,13]。Cassir等[11]对93例NEC患者和270名对照的最新研究结果显示,丁酸梭菌与NEC发生高度相关(P<0.001);与对照组相比,自NEC患者体内分离的丁酸梭菌其培养物呈现出较强的细胞毒性(P=0.008),并从所有的丁酸梭菌菌株中鉴定出编码β-溶血素的相关基因,该基因是引起猪痢疾的猪痢疾密螺旋体所拥有的,进一步确证丁酸梭菌和NEC发生相关。
        本次NEC事件暴发涉事的妇幼保健院新生儿病房为刚投入使用的新病房,使用后15 d左右即出现首例NEC病例。在疾病暴发期间采集的不同来源的样品中,分离出同PFGE型别的丁酸梭菌和生胞梭菌,说明所有样品中分离到的丁酸梭菌和生胞梭菌均分别来自同一污染源。并且在该院采取彻底消毒后,再次采集的样品中均未检出任何梭状芽孢杆菌,消毒后该院也未再出现新的NEC病例,说明该起NEC暴发事件与梭状芽孢杆菌特别是丁酸梭菌的污染高度相关。
        值得注意的是,医护人员手及其所接触的物体如心电监护仪、输液泵、听诊器、电话等表面涂抹样品仅检出丁酸梭菌,提示丁酸梭菌的污染可能源自医护人员,医护人员的活动是导致后续病房环境、仪器设备、患儿进食乳粉受到丁酸梭菌污染的根本原因。此外,母乳盒内壁、冰箱内壁及患儿暖箱把手涂抹样品、患儿粪便样品均受到丁酸梭菌和生胞梭菌的双重污染,且污染的丁酸梭菌与来自医护人员手丁酸梭菌的PFGE型相同,进一步说明丁酸梭菌源自医护人员。此外,母乳和母乳保鲜袋内壁涂抹样品仅检出生胞梭菌,且母乳盒内壁、冰箱内壁及患儿暖箱把手涂抹样品在检出丁酸梭菌的同时还检出生胞梭菌,提示生胞梭菌源自母乳。可能由于患儿母亲卫生习惯欠佳、挤奶时生胞梭菌污染乳汁,由此导致后续与母乳接触的所有媒介如盛放母乳的保鲜袋和盒内壁、储存母乳的冰箱内壁、进食母乳的患儿及患儿暖箱把手等被该菌污染。鉴于迄今为止世界上尚无生胞梭菌引起NEC的报道,且本实验室在2013年新西兰乳清蛋白粉污染肉毒梭菌事件进行的大量动物实验结果显示,虽然生胞梭菌培养物腹腔注射小鼠可引起动物出现有别于肉毒梭菌毒素所致动物中毒和死亡的表现[14],但将生胞梭菌培养物以经口灌胃方式给予小鼠后,动物并无异常表现。因此推断,该起NEC的集中暴发与丁酸梭菌的院内感染密切相关。建议各医院儿科门诊及病房高度重视院内丁酸梭菌的污染监控,并深入开展丁酸梭菌致NEC发生机制的研究,为该病的临床诊治提供有力的技术支持。

参考文献
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