中华预防医学杂志    2018年02期 登革病毒非结构蛋白1抗原检测试剂的比较    PDF     文章点击量:469    
中华预防医学杂志2018年02期
中华医学会主办。
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吴德 赵令斋 吴衍恒 张欢 张萌 谈琦琪 周惠琼 张复春 何剑峰
WuDe,ZhaoLingzhai,WuYanheng,ZhangHuan,ZhangMeng,TanQiqi,ZhouHuiqiong,ZhangFuchun,HeJianfeng
登革病毒非结构蛋白1抗原检测试剂的比较
Comparison of Dengue viral nonstructural protein 1 antigen testing kits
中华预防医学杂志, 2018,52(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.02.005

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投稿日期: 2017-02-08
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登革病毒非结构蛋白1抗原检测试剂的比较
吴德 赵令斋 吴衍恒 张欢 张萌 谈琦琪 周惠琼 张复春 何剑峰     
吴德 511430 广州,广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所
赵令斋 广州市第八人民医院感染科
吴衍恒 中山市疾病预防控制中心微生物检验科
张欢 511430 广州,广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所
张萌 511430 广州,广东省疾病预防控制中心传染病预防控制所
谈琦琪 511430 广州,广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所
周惠琼 511430 广州,广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所
张复春 广州市第八人民医院感染科
何剑峰 511430 广州,广东省疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要: 目的  调查登革热病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测试剂的敏感性和特异性,为诊断标准的修订提供依据。方法  于2010年5月至2016年11月,从广州、东莞和中山三地登革热监测点医院,共收集核酸检测或病毒培养物阳性者300例。同期同地采集登革病毒核酸阴性的人群血液标本308例作为对照组。采用调查问卷收集研究对象的相关信息。分别选用胶体金试剂(国产和进口)、ELISA试剂(国产和进口)在上述3个城市进行登革热抗原检测,计算并比较不同试剂的灵敏度、特异度和符合率,以中山地区作为第三方检测。结果  阳性组男性为133例,女性为167例,年龄为(47.2±13.3)岁,其中登革Ⅰ型为179例,登革Ⅱ型为110例,登革Ⅲ型为11例;对照组男、女病例均为154例,年龄为(40.1±11.6)岁。国产ELISA试剂灵敏度(94.5%)低于进口试剂(99.5%),差异有统计学意义(χ2=8.59,P=0.030);NS1抗原检测Ⅰ型登革病毒的灵敏度和特异度均高于97.0%;检测Ⅱ型登革病毒时,国产ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为90.0%和95.0%,特异度分别为96.8%和100%,进口ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为100%和98.0%,特异度分别为99.4%和100%。第三方检测结果显示国产ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为90.0%和98.0%,差异有统计学意义(χ2=5.67,P=0.020)。结论  NS1检测试剂均具有较高的灵敏度和特异度,可以作为登革热病例的早期筛查检测。
关键词 :登革热;酶联免疫吸附测定;抗原
Comparison of Dengue viral nonstructural protein 1 antigen testing kits
WuDe,ZhaoLingzhai,WuYanheng,ZhangHuan,ZhangMeng,TanQiqi,ZhouHuiqiong,ZhangFuchun,HeJianfeng     
Center for Disease Control and Prevention of Guangdong Province, Guangzhou 511430, China
Corresponding author: He Jianfeng, Email: hjf@cdcp.org.cn
Abstract:Objective  To investigate the sensitivity and specificity of commercial nonstructural protein 1 (NS1) testing kits for Dengue fever diagnose, and provide the evidence for diagnostic criteria revision.Methods  300 PCR or virus isolation positive blood samples for dengue virus were collected from sentinel hospitals for dengue surveillance in Guangzhou, Dongguang and Zhongshang from May 2015 to Nov. 2016. At the same time, 308 PCR negative samples for Dengue virus were collected as control group. The information of the sample was collected using questionnaires. These samples were tested using imported and domestic ELISA and the colloidal gold-labeled kits that were widely used for detecting dengue NS1. Sensitivity, specificity and coincidence were calculated and analyzed, and Z hongshan's result was regarded as the reslut of the third part.Results  The positive group includes 133 males and 167 females, average ages are 47.2±13.3, 179, 110 and 11 of them is Dengue Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ respectively. The negative group includes 154 males and 154 females, average ages are (40.1±11.6) years old. The sensitivity of domestic ELISA Kits (94.5%) is less than imported (99.5%), and the result has statistical significance (χ2=8.59, P=0.030), the specificity is 99.7% and 97.7% respectively; The sensitivity of imported and domestic the colloidal gold-labeled Kits is 97.5% and 96.5% respectively, both of specificities are 100%. The sensitivity and specificity of Dengue Ⅰ for NS1 test are more than 97.0%. The sensitivity of domestic ELISA and gold-labeled Kits is 90.0% and 95.0%, and the specificity is 96.8% and 100% respectively for Dengue Ⅱ test. The sensitivity of imported ELISA and gold-labeled Kits is 100% and 98.0%, and the specificity is 99.4% and 100% respectively for Dengue Ⅱ test. The result of the third party show the sensitivity and specificity of domestic ELISA and gold-labeled Kits are 90.0% and 98.0%, the differences has statistical significance (χ2=5.67, P=0.020).Conclusion  NS1 testing can be used as early dengue fever diagnose for higher sensitivity and specificity.
Key words :Dengue;Enzyme-linked immunosorbent assay;Antigens
全文

登革热是世界上传播最快的蚊媒病毒性疾病。在过去的50年里,随着登革热流行区域的不断扩张,很多未出现登革热的国家出现了登革热,并且还呈现从城市向乡村的蔓延趋势,登革热的发病率增加了近30倍[1]。WHO估计每年全球有近5千万人感染,大约有25亿人生活在登革热流行地区,其中70%以上分布在东南亚和西太平洋地区[2]。中国东南沿海和云南等地区是受登革热影响较为严重的地区,从1978年到2008年,共有3次大规模的登革热暴发,共报告感染病例655 324例,死亡610例[3]。2014年登革热再次在广东省流行,共造成45 000多例感染,6例死亡[4]
        中国登革热病例主要为境外输入病例和输入后引起的本地病例[5,6,7,8],因此,早期发现、早期诊断和早期控制是防控登革热的关键措施。核酸检测是登革热早期诊断的一个重要手段,但这种方法由于技术要求高,成本大和易污染等特点,很难在基层医疗和卫生机构开展。WHO在《登革热防控全球战略(2012—2020)》中指出,非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)检测作为登革热的常规检测,可用于登革热的早期诊断[9,10]。当前,在我国市场上销售的、可用于登革热NS1早期检测的试剂主要有ELISA和胶体金方法2种,但不同试剂盒的灵敏度和特异度都存在一定的差异。因此,有必要对NS1的早期诊断价值进行科学评估,从而为指导基层医疗卫生机构的正确使用和中国登革热诊断标准的修订提供实验依据。

对象与方法  

一、对象  

1.样本量计算:  本研究属于筛检试验,采用公式进行样本量估算,其中α=0.05,δ=0.10(容许误差),根据文献报道[11]P为估算的筛检试验灵敏度或特异度,假设NS1抗原检测的灵敏度约为90.0%,特异度约为80.0%。经公式计算出阳性组样本量至少为35份,对照组样本量至少为61份。

2.对象:  (1)阳性组:于2010年5月至2016年11月,广东省登革热监测项目期间,从广州、东莞和中山三地登革热监测点医院收集的登革热为发病后1~5 d内的病例标本,核酸检测或病毒培养物阳性者,共300例。(2)对照组:同期在上述3个地市登革热监测点医院采集的登革病毒核酸阴性的人群血液标本,包括健康体检的健康人血液标本,丙型肝炎IgM抗体阳性的病例标本,基孔肯雅热PCR检测阳性或抗体阳性的病例血液标本,恙虫病IgM抗体或核酸阳性的临床诊断病例血液标本,乙型脑炎IgM抗体阳性的临床诊断病例血液标本,共308例。所有研究对象均签署了知情同意书。本研究通过了广东省疾病预防控制中心医学伦理委员会的审核[批号:(2017)007]。

二、方法  

1.问卷调查:  采用自行设计的问卷收集研究对象的基本信息,包括姓名、型别、年龄、职业和家庭地址等;发病就诊情况,包括发病地址、发病日期、主要症状和临床诊断等;实验室检测情况;发病前后活动情况等。

2.样本采集:  用10 ml无菌真空干燥管采集患者和健康人非抗凝血,每次采集静脉血液标本5 ml以上,室温放置30 min,2 h内分离血清。-70 ℃以下保存,用于登革热等病原体的相关检测。

3.试剂:  核酸检测试剂选用广州达安登革热Real-time核酸检测试剂盒(金标准),快速法NS1快速检测试剂盒选用"Panbio dengue early rapid"(澳大利亚Panbio)和"登革病毒NS1抗原检测试剂盒"(国产胶体金);ELISA法NS1抗原检测试剂盒选用"Panbio Dengue NS1 Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay"(澳大利亚Panbio)和"登革病毒NS1抗原检测试剂盒"(国产ELISA)。

4.检测方法:  标本检测分别在广东省疾病预防控制中心和广州市第八人民医院两家单位开展,第三方检测为中山市疾病预防控制中心,检测使用IMARK 680酶标仪(美国伯乐公司),每份标本均用统一采购的4种试剂开展检测。两种ELISA检测试剂使用的是捕获法,快速检测试剂为胶体金法,具体操作和结果判断按照试剂盒说明书进行。

5.质量控制:  用ELISA检测试剂均设立阴阳性对照,阴阳性结果成立认为检验结果可靠,否则视为无效,对检测结果出现可疑的临床标本,需重复进行实验,如结果一致可判读为阳性。胶体金检测试剂设立质控线,每次检测均需出现质控线,则认为检测结果可靠,否则无效,需进行重复实验。

三、评价指标  

1.真实性:  灵敏度=a/p2;特异度=d/q2

2.可靠性:  符合率=(a+d)/n。上述公式中a为两种检测方法阳性一致样品数,d为两种检测方法阴性一致样品数,n为检测总样品数,p2为核酸检测阳性总数,q2为核酸检测阴性总数。

四、统计学分析  采用Excel 2010软件建立检测结果数据库,采用SPSS 20.0软件计算灵敏度、特异度和符合率;采用χ2检验比较阳性组和对照组的性别构成差异以及国产和进口试剂间的灵敏度和特异度差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

一、基本情况  300例阳性组中,男性为133例,女性为167例,年龄为(47.2±13.3)岁,其中登革Ⅰ型为179例,登革Ⅱ型为110例,登革Ⅲ型为11例。308名对照组中,男、女病例均为154例,年龄为(40.1±11.6)岁,其中健康人群血液标本150份,丙型肝炎病例血液标本50份,基孔肯雅热核酸或抗体阳性血液标本18份,恙虫病核酸或抗体阳性血液标本60份,乙型脑炎IgM抗体阳性病例血液标本30份。

二、NS1抗原检测  NS1抗原检测试剂的灵敏度均高于94.5%,特异度均高于97.7%;符合率均高于96.5%。国产ELISA试剂灵敏度稍低于进口试剂,差异有统计学意义(P=0.030)。详见表1

表1不同登革病毒NS1抗原检测试剂的各指标比较

三、不同型别登革病毒的NS1检测  NS1抗原检测Ⅰ型登革病毒的灵敏度和特异度均高于97.0%(表2);检测Ⅱ型登革病毒时,国产ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为90.0%和95.0%,特异度分别为96.8%和100%,进口ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为100%和98.0%,特异度分别为99.4%和100%(表3)。

表2不同NS1抗原检测试剂对Ⅰ型登革病毒检测的各指标比较
表3不同NS1抗原检测试剂对Ⅱ型登革病毒检测的各指标比较

四、NS1抗原检测试剂的交叉反应  国产ELISA方法在基孔肯雅热病例和恙虫病病例中检出登革热抗体阳性,分别为1例和3例。其他NS1抗原检测试剂在基孔肯雅热、乙型脑炎、丙型肝炎、恙虫病病例中均未检测出登革热阳性病例。

五、第三方检测结果  中山市疾病预防控制中心对100例登革热实验室确诊病例的血清标本进行检测,国产ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为90.0%和98.0%,差异有统计学意义(χ2=5.67,P=0.020),进口ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为94.0%和97.0%,差异无统计学意义(Fisher精确概率法,P=0.500)。

讨论  NS1抗原在登革病例早期血清中存在的时间较长,因此在全球范围内被广泛应用于登革热的早期诊断。2014年登革热在我国广东等多个省出现了暴发或流行[12],为快速有效控制登革热疫情的进一步蔓延,国家卫生计生委发布了《登革热病例监测指南2014》,并将NS1检测作为登革热实验室诊断的重要手段之一,此外还准备将登革病毒NS1检测纳入到即将修订的登革热诊断标准中。由于我国之前未有大量使用NS1检测的经验,NS1检测是否可以作为一种常规的检测手段,国内流通的NS1检测试剂是否可以满足我国登革热检测筛查的需求,为此我们对国内外相关的NS1检测试剂进行了评估。
        从国外的文献报道来看[13,14],一般来说ELISA的敏感性通常要高于胶体金,本次研究的国外试剂也与报道一致,而国内胶体金试剂的敏感性却高于ELISA。进一步研究发现,国产ELISA在登革Ⅰ型的检测敏感性要高于胶体金,而Ⅱ型的检测中敏感性只有90.0%,远低于胶体金的95.0%,这可能是使用了针对不同病毒型别的单克隆抗体而造成了检测敏感性的差异。
        考虑到检测试剂对不同登革型别登革热检测敏感性的不同,在本次研究中选用了登革Ⅰ型和Ⅱ型病例标本。由于登革Ⅲ型和Ⅳ型在本次研究中未收集到足够的临床样本,未能在本次研究中进行评估,一定程度上给研究的全面性,代表性造成影响,这是本次研究不足之处。从分子进化的角度来看,Ⅰ型和Ⅲ型,Ⅱ型和Ⅳ型具有较近的亲缘关系,其NS1抗原结构也有一定的相似性,因而对其检测的敏感性也较接近[15],从而在一定程度上弥补了研究的不足。此外,在项目设计过程中增加了第三方检测,一方面是为了检验两家评估单位的检测结果,另一方面也是满足登革热诊断标准修订的条件要求。本研究中第三方检测结果与2家评估单位结果一致,进一步证实了本次研究的可靠性。
        综上所述,本次研究科学评价了4种国内外NS1检测试剂。无论是ELISA还是胶体金标记方法,NS1抗原检测在病例发病早期(5 d内)均具有很高的灵敏度、特异度和符合率。因此认为,NS1检测可以作为登革热早期病例的筛查手段之一,具有较大实用价值,可以纳入登革热早期诊断的实验标准中。

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