中华预防医学杂志    2018年02期 邻苯二甲酸单丁酯对小鼠睾丸间质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响    PDF     文章点击量:307    
中华预防医学杂志2018年02期
中华医学会主办。
0

文章信息

龚盼 芦红超 张畅 陈珊珊 王玉邦
GongPan,LuHongchao,ZhangChang,ChenShanshan,WangYubang
邻苯二甲酸单丁酯对小鼠睾丸间质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响
Effects of monobutyl phthalate on migration and invasion of mouse Leydig tumor cells
中华预防医学杂志, 2018,52(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.02.011

文章历史

投稿日期: 2017-03-27
上一篇:油炸食品摄入与胃癌及癌前病变的相关因素分析
下一篇:职业卫生检测实验室对血铅和尿镉测定能力的评价与分析
邻苯二甲酸单丁酯对小鼠睾丸间质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响
龚盼 芦红超 张畅 陈珊珊 王玉邦     
龚盼 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学实验室
芦红超 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学实验室
张畅 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学实验室
陈珊珊 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学实验室
王玉邦 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学实验室;江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心
摘要: 目的  探讨邻苯二甲酸单丁酯(MBP)对小鼠睾丸间质瘤细胞(MLTC-1)上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达及细胞迁移、侵袭能力的影响。方法  选择0、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L浓度的MBP分别处理MLTC-1细胞24 h和48 h后,收集处理后细胞。采用噻唑蓝(MTT)实验检测细胞活性,Western blot检测EMT相关蛋白波形蛋白、E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白和Snail的表达,划痕实验及Transwell细胞侵袭实验探讨MBP对MLTC-1细胞迁移和侵袭能力的影响。结果  使用10-7、10-6 mol/L的MBP对MLTC-1细胞染毒时,波形蛋白、转录因子Snail、N-钙黏着蛋白表达上调[相对表达量分别为(1.56±0.07)比(1.78±0.08)、(1.22±0.06)比(1.44±0.07)、(1.33±0.11)比(2.19±0.06),P值均<0.001];E-钙黏着蛋白的相对表达量分别为(0.66±0.09)比(0.47±0.06),表达下调(P<0.001)。划痕实验显示,分别以0、10-7、10-6 mol/L MBP染毒24 h后,细胞划痕愈合能力明显提高,愈合率分别为(6.64±2.07)%、(15.61±2.83)%、(39.91±0.33)%,P值均<0.001。Transwell实验显示,使用0、10-7、10-6 mol/L浓度的MBP染毒后,各组穿过Matrigel胶的细胞数与对照组相比明显增加,24 h侵袭细胞数(32.67±3.51)、(57.67±2.52)、(82.67±6.51)个/每3个视野,P值均<0.001。结论  MBP影响了MLTC-1细胞EMT相关蛋白的表达,促进了MLTC-1细胞的迁移和侵袭。
关键词 :小鼠;睾丸;邻苯二甲酸单丁酯;上皮间质转化;迁移
Effects of monobutyl phthalate on migration and invasion of mouse Leydig tumor cells
GongPan,LuHongchao,ZhangChang,ChenShanshan,WangYubang     
Department of Safety Assessment and Research Center for Drug, Pesticide and Veterinary Drug of Jiangsu Province, The Key Laboratory of Modern Toxicology, Ministry of Education, School of Public Health, Nanjing Medical University, Nanjing 211166, China
Corresponding author: Wang Yubang, Email: ncsa@njmu.edu.cn
Abstract:Objective  This study aimed to investigate the influence of monobutyl phthalate (MBP) on the expressions of epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related proteins, migration and invasion of mouse Leydig tumor cells (MLTC-1) cells.Methods  After exposed to different doses of MBP (0、10-7、10-6, 10-5, 10-4, 10-3 mol/L) for 24 h or 48 h, cell viability was determined by 3-(4 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay. Expressions of vimentin, E-cadherin, N-cadherin and Snail proteins related to EMT were detected by Western blot. The ability of migration and invasion of MLTC-1 were assessed by wound healing assay and Transwell Boyden chamber assay, respectively.Results  Relative expressions of vimentin, Snail and N-cadherin proteins were promoted ((1.56±0.07) vs (1.78±0.08), (1.22±0.06) vs (1.44±0.07), (1.33±0.11) vs (2.19±0.06), all P values were<0.001) and E-cadherin (0.66±0.09) vs (0.47±0.06), P<0.001,protein was inhibited after the cells stimulated with MBP (0, 10-7 and 10-6 mol/L). The capability of wound closure of MLTC-1 cells were (6.64±2.07)%, (15.61±2.83)%, (39.91±0.33)%, respectively and the invading/migrating cells were (32.67±3.51), (57.67±2.52), (82.67±6.51), respectively, which were obviously increased under MBP treatments (0, 10-7 and 10-6 mol/L) (all P values were <0.001).Conclusion  Monobutyl phthalate affected the expressions of EMT-related proteins and enhanced the migration and invasion of MLTC-1 cells.
Key words :Mice;Testis;Monobutyl phthalate;Epithelial-mesenchymal transition;Migration
全文

邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate, DBP)和其代谢产物邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate, MBP)是一类重要的环境内分泌干扰物,影响人类的生殖、发育和行为。DBP通过在体内代谢为MBP发挥作用[1]。人群广泛低剂量、长期接触DBP或MBP可干扰类固醇激素合成,从而影响生殖系统功能。动物实验表明,DBP能干扰正常生殖系统的功能,如胚胎期暴露于DBP可引起生殖细胞数量下降、精子密度降低、精子数量减少、异常形态精子数量增多、隐睾、尿道下裂等表现[2,3,4]。人群流行病学研究也发现,DBP/MBP与人类精子浓度下降和精子总数减少密切相关[5]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是胚胎发育的重要特征,指细胞失去上皮特性获得间质特性的过程,可在形态发育、转录水平促使恶性肿瘤细胞发生转移侵袭[6]。EMT是一种重要的肿瘤侵袭和转移机制,对肿瘤干细胞的生成可能存在促进作用[7]。DBP也可以导致激素依赖性器官肿瘤发病率增加,可能与睾丸生殖细胞癌有关[8],但缺乏直接的证据。本研究探讨MBP在低剂量下对小鼠睾丸间质瘤细胞(mouse leydig tumor cells, MLTC-1)EMT相关蛋白波形蛋白、E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白和转录因子Snail表达,以及对细胞迁移、侵袭能力的影响。

材料与方法  

1.材料:  (1)细胞:MLTC-1购自中国科学院上海细胞生物研究所。(2)试剂:MBP购自日本Tokyo Kasei Kogyo有限责任公司;RPMI1640培养基及胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;抗体CST试剂盒购自美国Cell Signaling公司;吡啶酸钠盐(bicinchoninic acid,BCA)蛋白质浓度检测试剂盒、RIPA裂解液以及PMSF购自碧云天生物技术有限公司;Transwell小室购自美国Millipore公司。

2.方法:  (1)细胞培养与处理:将MLTC-1细胞接种至含10%FBS的RPMI 1640培养液中,置于37 ℃,放入体积分数为5%CO2的细胞恒温培养箱中培养,待细胞增殖铺满培养皿80%后传代至指定的培养皿或培养板孔中以不同浓度的MBP(10-7 mol/L和10-6 mol/L)处理,收集所得细胞。(2)细胞活性实验[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]:收集对数生长期细胞,调整细胞悬液浓度至5×104个/ml,接种于96孔板,200 μl/孔,即104个细胞/孔。置于37 ℃、体积分数为5% CO2细胞恒温培养箱培养24 h使细胞贴壁。选择0、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L浓度的MBP处理细胞24 h和48 h。以质量分数为0.1%DMSO为溶剂对照组。TECAN多功能酶标仪Infinite M200测定各孔的吸光值(A),计算细胞相对存活率。(3)Western blot检测蛋白的表达:收集处理后的细胞,用BCA法测定蛋白浓度。取总蛋白50 μg,煮沸5 min,变性后上样,进行SDS-PAGE凝胶电泳,湿转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜,质量分数为5%脱脂奶粉室温封闭1 h,一抗4 ℃孵育过夜;二抗室温孵育1 h;滴加电化学发光免疫测定(electro-chemi-luminescence, ECL)化学发光液,伯乐凝胶成像仪中曝光显影。用AlphaEaseFC软件分析蛋白表达水平,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为蛋白内参,进行定量分析。(4)划痕实验:将处于对数生长期的MLTC-1细胞接种于6孔培养板中,置37 ℃、体积分数为5% CO2细胞恒温培养箱中培养。待细胞覆盖孔底形成单层后,用10 μl滴头在培养板呈直线形划痕,划痕形成后采用PBS进行2次冲洗,用无血清培养基培养24 h,记录划痕区域细胞的迁移情况。(5)Transwell侵袭实验:取对数生长期细胞,消化、离心调整细胞密度接种于24孔板,孔内加入600 μl含质量分数为10% FBS的RPMI1640培养液。预先用Matrigel基质30 μl铺于Transwell(孔径8 μm)小室的膜上,37 ℃放置6 h使基质胶凝固成固体层。把Transwell小室放入24孔内,小室内加入100 μl无血清细胞悬液,并加0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)维持渗透压,小室依次加入不同试剂,分别为对照组和MBP剂量组。24 h后用棉签擦去Transwell上室面的细胞,下室面的细胞用预冷的甲醇4 ℃固定30 min。放入质量分数为1%的结晶紫溶液内,37 ℃染色30 min,PBS轻轻洗去多余的颜色,倒置显微镜下随机选取3个视野计数穿越小室的细胞数。

3.统计学分析:  采用SPSS 20.0统计软件分析。MLTC-1细胞活力、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白和Snail蛋白相对表达灰度值、增殖侵袭相对指数结果分布为正态分布,以±s表示。组间均数比较用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.MBP对MLTC-1细胞活力的影响:  不同剂量MBP处理后,MBP在10-3 mol/L时细胞相对活性显著下降,而其他剂量组差异没有统计学意义(表1)。本研究选用10-7 mol/L和10-6 mol/L MBP作用于MLTC-1细胞24 h。

表1不同染毒剂量下MBP对小鼠MLTC-1细胞活力相对表达量的影响(±sn=3)

2.Western blot检测MLTC-1细胞EMT相关蛋白的表达:  在内参蛋白表达一致的情况下,MBP在10-7 mol/L和10-6 mol/L时,与对照组相比,可观察到,波形蛋白、N-钙黏着蛋白以及转录因子Snail蛋白相对表达量上升,E-钙黏着蛋白相对表达量下降(P<0.05,表2)。

表2不同染毒剂量下MBP对小鼠MLTC-1细胞EMT相关蛋白相对表达量的影响(±sn=3)

3.细胞划痕实验:  与对照组相比,MBP染毒剂量为10-7、10-6 mol/L剂量组作用24 h后,细胞数量增加,条带变宽(图1),表示细胞增殖、迁移能力增强(表3)。

图1不同染毒剂量下MBP对MLTC-1细胞增殖能力的影响
表3不同染毒剂量下MBP对小鼠MLTC-1细胞划痕愈合程度的影响(±sn=3)

4.MBP对细胞侵袭能力的影响:  与对照组相比,10-7、10-6 mol/L的MBP在作用细胞24 h后,MLTC-1细胞穿透Matrigel胶和Transwell小室微孔膜的细胞数明显增多,细胞侵袭能力增强(图2表4)。

图2不同染毒剂量下MBP对MLTC-1细胞侵袭能力的影响
表4不同染毒剂量下MBP对MLTC-1细胞侵袭能力的影响(±sn=3)

讨论  最新报道显示,邻苯二甲酸酯(PAEs)与乳腺癌以及卵巢癌有密切联系[9,10]。目前,大多数研究关注于高剂量DBP(如500 mg/kg每天)对雄性生殖系统的毒性作用,导致睾丸和附睾发育异常、生精小管严重萎缩、精子发生障碍和血清激素水平异常[11]。本课题组前期研究表明DBP/MBP可能存在类固醇激素合成的双向调节作用,即低剂量刺激作用、高剂量抑制作用[1, 12]。因此,本实验在无毒效应剂量前提下选取较低的两个剂量组(10-7、10-6mol/L),探讨MBP对MLTC-1细胞迁移和侵袭能力是否同样存在低剂量刺激效应。
        EMT与肿瘤细胞的干细胞特征密切相关,肿瘤的发生往往伴随EMT过程的发生。在人类肿瘤和动物模型中的许多研究表明,EMT在胚胎形成和肿瘤发生中有重要作用[13]。肿瘤细胞发生EMT过程中伴随着特征性蛋白表达的变化,如Snail、N-钙黏着蛋白和波形蛋白表达的升高和E-钙黏着蛋白表达的降低[14,15]。E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白是钙黏蛋白家族成员,与肿瘤侵袭转移密切相关,分别表达于上皮细胞和间质细胞,癌细胞从E-钙黏着蛋白表达向N-钙黏着蛋白表达转移是EMT的一个重要机制,EMT主要的标志是E-钙黏着蛋白的缺失[16]。EMT受多因子参与的信号网络调控,其中转录因子Snail可能与肿瘤的发生发展密切相关[17]
        本研究显示,低剂量MBP作用于MLTC-1细胞时,可观察到N-钙黏着蛋白、波形蛋白和转录因子Snail表达的显著上调,而E-钙黏着蛋白表达水平显著下调。波形蛋白是EMT重要的间质细胞标志物,在维持间质特性中发挥重要作用。有报道显示,波形蛋白与肿瘤的侵袭转移特性也具有普遍联系,波形蛋白表达增加可能一定程度上促进了细胞的侵袭能力[18]。E-钙黏着蛋白与N-钙黏着蛋白在肿瘤形成中为一种互斥性的关系,即E-钙黏着蛋白的表达下调与N-钙黏着蛋白的表达上调。本研究结果证实了这一现象,即低剂量MBP在上调MLTC-1细胞N-钙黏着蛋白表达的同时也使得E-钙黏着蛋白表达下调。N-钙黏着蛋白异常表达与肿瘤细胞成纤维细胞样形态改变密切相关,可使得肿瘤细胞活动性增加,从而更容易迁移和侵袭[19,20,21]。划痕实验和Transwell实验结果同时证明,MLTC-1细胞暴露于低剂量MBP时,迁移和侵袭能力明显高于对照组。因此,MBP能够影响MLTC-1细胞EMT过程相关蛋白的表达,促进EMT的发生。在胚胎发育的研究中,转录因子Snail在调控胚胎EMT过程及肿瘤转移中具有重要作用。本实验中我们发现Snail蛋白表达增加,且细胞的运动与侵袭力增强,提示Snail在MBP促进MLTC-1 EMT过程中发挥重要作用。
        综上所述,MBP低剂量暴露影响MLTC-1细胞中EMT相关蛋白的表达,促进细胞侵袭和转移。提示DBP/MBP可能促进生殖系统肿瘤的发生,虽然目前还没有直接证据表明DBP/MBP是直接致癌物。本研究结果为进一步研究DBP/MBP促进肿瘤发生的机制,预防肿瘤疾病发病提供了理论基础。

参考文献
[1]LiY, HuY, DongC, et al. Vimentin-mediated steroidogenesis induced by phthalate esters: involvement of DNA demethylation and nuclear factor κB[J].PLoS One,2016,11(1):e0146138. DOI: 10.1371/journal.pone.0146138.
[2]WangY, SongL, HongX, et al. Low concentrations mono-butyl phthalate stimulates steroidogenesis by facilitating steroidogenic acute regulatory protein expression in mouse Leydig tumor cells (MLTC-1)[J]. Chem Biol Interact, 2006,164(1-2):15-24. DOI: 10.1016/j.cbi.2006.08.022.
[3]LiN, ChenX, ZhouX, et al. The mechanism underlying dibutyl phthalate induced shortened anogenital distance and hypospadias in rats[J]. J Pediatr Surg, 2015,50(12):2078-2083. DOI: 10.1016/j.jpedsurg.2015.08.046.
[4]AlyHA, HassanMH, El-BeshbishyHA, et al. Dibutyl phthalate induces oxidative stress and impairs spermatogenesis in adult rats[J]. Toxicol Ind Health, 2016,32(8):1467-1477. DOI: 10.1177/0748233714566877.
[5]WangYX, YouL, ZengQ, et al. Phthalate exposure and human semen quality: Results from an infertility clinic in China[J]. Environ Res, 2015,142:1-9. DOI: 10.1016/j.envres.2015.06.010.
[6]WellsA, ChaoYL, GrahovacJ, et al. Epithelial and mesenchymal phenotypic switchings modulate cell motility in metastasis[J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2011,16:815-837.
[7]YuJ, LiaoX, LiL, et al. A preliminary study of the role of extracellular-5'- nucleotidase in breast cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2017,53(2):132-140. DOI: 10.1007/s11626-016-0089-y.
[8]SaffariniCM, HegerNE, YamasakiH, et al. Induction and persistence of abnormal testicular germ cells following gestational exposure to di-(n-butyl) phthalate in p53-null mice[J]. J Androl, 2012,33(3):505-513. DOI: 10.2164/jandrol.111.013706.
[9]ParkMA, HwangKA, LeeHR, et al. Cell growth of BG-1 ovarian cancer cells is promoted by di-n-butyl phthalate and hexabromocyclododecane via upregulation of the cyclin D and cyclin-dependent kinase-4 genes[J]. Mol Med Rep, 2012,5(3):761-766. DOI: 10.3892/mmr.2011.712.
[10]HsiehTH, TsaiCF, HsuCY, et al. n-Butyl benzyl phthalate promotes breast cancer progression by inducing expression of lymphoid enhancer factor 1[J]. PLoS One, 2012,7(8):e42750. DOI: 10.1371/journal.pone.0042750.
[11]王玉邦,宋玲,朱正平,等.邻苯二甲酸二丁酯对大鼠睾丸支持细胞的影响[J].中华预防医学杂志,2005,39(3):179-181. DOI: 10.3760/j:issn:0253-9624.2005.03.008.
[12]LuH, ZhangC, HuY, et al. miRNA-200c mediates mono-butyl phthalate-disrupted steroidogenesis by targeting vimentin in Leydig tumor cells and murine adrenocortical tumor cells[J]. Toxicol Lett, 2016,241:95-102. DOI: 10.1016/j.toxlet.2015.11.009.
[13]AcloqueH, AdamsMS, FishwickK, et al. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease[J]. J Clin Invest, 2009,119(6):1438-1449. DOI: 10.1172/JCI38019.
[14]FengH, LuJJ, WangY, et al. Osthole inhibited TGF β-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) by suppressing NF-κB mediated Snail activation in lung cancer A549 cells[J].Cell Adh Migr,2017:1-12. DOI: 10.1080/19336918.2016.1259058.
[15]赵俊军,吕娇,李平. Cripto-1蛋白、E-钙粘蛋白和波形蛋白在乳腺癌中的表达及其意义[J].中国实验诊断学,2017,21(1):17-22. DOI: 10.3969/j.issn.1007-4287.2017.01.006.
[16]包俊杰,吴诚义. E-cadherin、N-cadherin与CD44+/CD24-/low表型在乳腺癌中表达的相关性及其意义[J].中国癌症杂志,2010,20(8):596-601. DOI: 10.3969/j.issn.1007-3639.2010.08.007.
[17]YangX, HanM, HanH, et al. Silencing Snail suppresses tumor cell proliferation and invasion by reversing epithelial-to-mesenchymal transition and arresting G2/M phase in non-small cell lung cancer[J]. Int J Oncol, 2017,50(4):1251-1260. DOI: 10.3892/ijo.2017.3888.
[18]SethiS, MacoskaJ, ChenW, et al. Molecular signature of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human prostate cancer bone metastasis[J]. Am J Transl Res, 2010,3(1):90-99.
[19]HazanRB, PhillipsGR, QiaoRF, et al. Exogenous expression of N-cadherin in breast cancer cells induces cell migration, invasion, and metastasis[J]. J Cell Biol, 2000,148(4):779-790.
[20]LiG, SatyamoorthyK, HerlynM. N-cadherin-mediated intercellular interactions promote survival and migration of melanoma cells[J]. Cancer Res, 2001,61(9):3819-3825.
[21]Rieger-ChristKM, LeeP, ZaghaR, et al. Novel expression of N-cadherin elicits in vitro bladder cell invasion via the Akt signaling pathway[J]. Oncogene, 2004,23(27):4745-4753. DOI: 10.1038/sj.onc.1207629.