中华预防医学杂志    2018年02期 2014年山东省1株柯萨奇病毒B5分离株全基因序列分析    PDF     文章点击量:310    
中华预防医学杂志2018年02期
中华医学会主办。
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王敏 韦庆娟 李娟 江新泉 张振杰 童贻刚 丁淑军 王显军 史卫峰
WangMin,WeiQingjuan,LiJuan,JiangXinquan,ZhangZhenjie,TongYigang,DingShujun,WangXianjun,ShiWeifeng
2014年山东省1株柯萨奇病毒B5分离株全基因序列分析
Full-length genome analysis of a coxsackievirus B5 strain isolated from Shandong Province in 2014
中华预防医学杂志, 2018,52(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253.9624.2018.02.013

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投稿日期: 2017-04-21
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2014年山东省1株柯萨奇病毒B5分离株全基因序列分析
王敏 韦庆娟 李娟 江新泉 张振杰 童贻刚 丁淑军 王显军 史卫峰     
王敏 271000 泰安,泰山医学院山东省高等学校新发传染病病因流行病学实验室
韦庆娟 泰安市妇幼保健院产前筛查科
李娟 271000 泰安,泰山医学院山东省高等学校新发传染病病因流行病学实验室
江新泉 泰山医学院公共卫生学院
张振杰 271000 泰安,泰山医学院山东省高等学校新发传染病病因流行病学实验室
童贻刚 军事医学科学院微生物流行病研究所
丁淑军 山东省疾病预防控制中心病毒性传染病防治所
王显军 山东省疾病预防控制中心病毒性传染病防治所
史卫峰 271000 泰安,泰山医学院山东省高等学校新发传染病病因流行病学实验室
摘要:
关键词 :手足口病;序列分析;柯萨奇B组5型病毒;全基因组;VP1基因
Full-length genome analysis of a coxsackievirus B5 strain isolated from Shandong Province in 2014
WangMin,WeiQingjuan,LiJuan,JiangXinquan,ZhangZhenjie,TongYigang,DingShujun,WangXianjun,ShiWeifeng     
Shandong Universities Key Laboratory of Etiology and Epidemiology of Emerging Infectious Diseases, Taishan Medical College, Taian, Shandong 271000, China
Corresponding author: Shi Weifeng, Email: shiwf@ioz.ac.cn
Abstract:
Key words :Hand, foot, and mouth disease;Sequence analysis;Coxsackievirus B5;Full-length genome;VP1 gene
全文

肠道病毒属于小RNA病毒科(picornaviridae)、肠道病毒属(enterovirus,EV)。基于肠道病毒衣壳蛋白VP1序列,将人EV分为4个组:HEV-A、HEV-B、HEV-C和HEV-D,其中HEV-B包括所有的ECHO病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus, CV)B组(CVB)、CVA9、EV69以及近几年发现的一些新型别。目前,柯萨奇病毒B组有B1~B6血清型。
        自1957年起,美国、加拿大、希腊等先后有CVB5病毒与无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎和心包炎等疾病发生的报道[1,2,3]。我国1979年在1例猝死成年人的心肌中分离到CVB5 [4];1993年胡树春等[5]报道了沈阳1例新生儿感染CVB5死亡的病例;2001年安徽省发生CVB5引起的无菌性脑膜炎流行[6];2002和2008年在浙江省脑膜炎和脑炎病例中均检出了CVB5 [7];2011年河南也暴发CVB5引起的病毒性脑炎[8]。另外,在北京、福建、上海、山东等省市的手足口病病例中也分离到CVB5病毒[9,10]
        本研究从2014年自山东省无菌性脑炎患儿粪便中分离并鉴定出一株CVB5毒株,通过对其全基因组和VP1基因序列进行分析,研究其遗传特征及分子流行病学特点。

一、材料与方法  

1.细胞及病毒来源:  人喉鳞癌细胞系(human laryngeal carcinoma cell line 2, Hep-2)由山东省疾病预防控制中心病毒所提供,培养于含体积分数为10%胎牛血清及体积分数为1%双抗(青霉素-青链霉素混合溶液)的高糖基础培养基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)生长液中。临床粪便样本来自于2014年山东省滨州市1例无菌性脑炎患儿,保存于泰山医学院病原生物学研究所。

2.引物:  使用软件Primer 5.064设计用于肠道病毒检测的荧光定量PCR引物及探针,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3.病毒的分离与鉴定:  样本经Hep-2细胞体外连续扩增3次后,利用Trizol法提取病毒总RNA,采用TaKaRa公司生产的RT-PCR试剂盒(RR037A)对细胞培养物进行反转录获得cDNA,操作按照说明书进行。应用ABI 7500Fast(美国赛默飞世尔科技有限公司)进行荧光定量PCR检测,上游引物(5'~3'):CCTGAATGCGGCTAATCC,下游引物(5'~3'):TTGTCACCATWAGCAGYCA,探针序列:FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-BHQ1。反应体系总体积为25 μl,其中:GoldStarTaqMan Mixture(CW2625M,康为世纪生物科技有限公司)12.5 μl;病毒荧光定量上游引物(25 μmol/L)0.625 μl;下游引物(25 μmol/L)0.625 μl;探针(25 μmol/L)0.625 μl;无RNA酶的水6.875 μl;待测cDNA模板量3.75 μl。荧光定量PCR反应条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环。每个循环结束后检测荧光。荧光定量PCR结果显示为肠道病毒阳性。将细胞培养物送军事医学科学院微生物流行病研究所进行高通量测序,获得其全基因组序列。毒株的全基因组序列已提交至GenBank,登录号为KY352499。

4.生物信息学分析:  测得的病毒全基因组及VP1基因片段利用BLAST检索同源性序列。从GenBank下载CVB5的全基因序列利用Mega 5.1[11]软件内嵌的最大似然法构建进化树,并进行核苷酸、氨基酸同源性比对。用RDP3[12]和SimPlot 3.5.1软件对序列进行基因重组分析。同时对VP1基因序列使用BEAST v1.8.2[13]进行系统发育分析(1亿代),每1万代采一次样。路径抽样和踏脚石抽样检测均发现核酸替代模型严格分子钟、进化树先验概率模型SkyGrid为最佳组合,通过Treeannotator软件计算consensus进化树。

二、结果  

1.序列分析:  通过对高通量测序结果进行BLAST检索,鉴定毒株2014/SDBZ/CHN分属CVB5。2014/SDBZ/CHN毒株全基因组核苷酸序列长度为7 356 bp,编码区长6 558 bp,编码含2 185个氨基酸残基的多聚蛋白,无氨基酸插入和缺失,病毒全基因组结构符合EV特征。对本实验室分离的CVB5毒株2014/SDBZ/CHN与GenBank存储的CVB5全基因组(共19株)进行系统发育分析,可见20株CVB5病毒中有15株为中国分离株,这15株CVB5中国分离株位于同一分支,且与美国、英国、科威特和韩国的4株CVB5国外分离株(包括早期1954/85/UK和Faulkner株)属不同遗传谱系。同时,1株2010年德国分离株(Jena/AN1397,KX139461)位于中国分支内,此德国分离株与2009年中国山东分离株(JX276378)同源性98.4%。

2.同源性分析:  2014/SDBZ/CHN与其他19株CVB5病毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为69.0%~97.6%和67.7%~99.9%,其中3A、3B、3D区域核苷酸同源性较低,VP1和VP3区域氨基酸变异较大。详见表1。同源性分析还表明,2014/SDBZ/CHN与2009年江苏分离株(154-2,KP266577)同源性最高,核苷酸及其氨基酸同源性分别为91.5%和92.9%,其与CVB5原型株Faulkner(1951年分离)的核苷酸序列同源性为77.9%,氨基酸同源性为75.6%,差异较大。

表12014年山东省分离株2014/SDBZ/CHN与GenBank下载的CVB5基因组各区段同源性比较

3.VP1片段进化树构建及分析:  VP1进化树可划分成A~D 4个基因型(图1),其中基因型A包括CVB5原型株Faulkner和1974年、1977年及2001年欧洲的分离株,基因型B主要包含1996—2007年欧洲分离株,基因型C主要为1982—2015年中国、印度及欧洲分离株,基因D型包括1970—2012年美国和欧洲分离株,4个基因型核苷酸同源率为96.4%~99.9%。而基因型C又分为5个亚基因型(C0~C4)(图1),其内部核苷酸的同源率为99.0%~99.9%。C1~C4结果与以前的文献报道一致[14],C0为本研究首次命名。中国96.1%(49/51株)的CVB5分离株属于C3、C4亚型,其中C3亚型包含的国内分离株均分离自2009年山东省内,C4亚型的分支中包含2005—2014年国内山东、安徽、河南和云南等地的分离株。本研究分离获得的2014/SDBZ/CHN分离株位于C4分支,2014/SDBZ/CHN分离株同该分支国内毒株间核苷酸同源性为93.7%~96.3%。

图12014年山东省柯萨奇B组5型病毒VP1基因系统进化树

4.重组分析:  RDP、Bootscan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq等不同检测方法均检测出2014/SDBZ/CHN株有两处重组区域。一处开始断裂点在7 359,结束断裂点在4 379(Bootscan法,P<0.01),亲本序列分别为X67706和03001N/2011/CHN(JX017383);另外一处开始断裂点为4 802,结束断裂点为7 358(SiSscan法,P<0.01),亲本序列分别为2010/JS/CHN(KP266576)和SH1/2008/CHN(GU376747)。SimPlot 3.5.1软件分析进一步证实了上述重组信号的存在。2014/SDBZ/CHN在0~5 500区段,与2010/jiangsu/CHN(KP266576)株相似性最高(约99.0%)。

三、讨论  CVB组肠道病毒有可能像肠道病毒EV71和CVA16一样,成为与手足口病发生相关的重要病原体[15]。因此,在加强对EV71、CVA16等肠道病毒研究的同时,对于致病谱较广的CVB5病毒也需要投入更多的关注。
        到目前为止,GenBank数据库中已有20株CVB5的全基因组,其中包括2008—2014年15株中国分离株(包括2014/SDBZ/CHN)。基于CVB5全基因组核苷酸序列的系统发育分析表明,这15株国内CVB5病毒属于同一遗传分支,且与4株国外分离株的进化距离较远,位于不同的分支。而2010年1株德国分离株(Jena/AN1397,KX139461)位于中国分支内,且与2009年中国山东分离株(JX276378)高度同源性,这很可能是1例由中国传到德国的毒株跨地区传播事件。
        VP1基因是肠道病毒主要的表面抗原决定簇区,其核苷酸序列的变化与病毒变异及进化密切相关。本研究对GenBank数据库存储的CVB5分离株(包括2014/SDBZ/CHN株)全长VP1基因进行系统发育分析,结果显示所有CVB5病毒的VP1核苷酸序列可分为4个主要的基因型(A~D),这与之前的报道相同[14]。不同家系CVB5毒株抗原性和致病性的差异值得深入研究。基因型C可各再分为5个亚基因型,除了之前文献报道的C1~C4 [14],C0为本研究首次命名。C4亚型包含2005—2014年国内各地的分离株,说明C4已在我国流行多年,是我国主要的CVB5流行亚型。值得一提的是,山东省内C3和C4亚型在共同流行。另外,CVB5/SDBZ/2014分离株与2010年以来国内分离株的全基因组和VP1片段均位于同一分支,说明本研究中分离到的CVB5/SDBZ/2014株确系近期国内流行株。
        已有大量研究报道EV基因组普遍存在重组现象[7,14]。本研究结果发现,该分离株基因组也存在基因重组的可能。病毒基因重组对其生物学特性和致病性的影响仍需进一步研究,或为CVB5的防控带来更大的困难。

参考文献
[1]PapaA, DumaidiK, FranzidouF, et al. Genetic variation of coxsackie virus B5 strains associated with aseptic meningitis in Greece[J]. Clin Microbiol Infect, 2006,12(7):688-691. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2006.01476.x.
[2]McLeanDM, DonohueWL, SnellingCE, et al. Coxsackie B5 Virus as a Cause of Neonatal Encephalitis and Myocarditis[J]. Can Med Assoc J, 1961,85(19):1046-1048.
[3]MinamiK, TsudaY, MaedaH, et al. Acute transverse myelitis caused by Coxsackie virus B5 infection[J]. J Paediatr Child Health, 2004,40(1-2):66-68.
[4]何丽芳,范之譁,闻玉梅.从猝死成人心肌分离柯萨奇B_5病毒[J].上海第一医学院学报,1979(5):329-333+385-386.
[5]胡树春,吴红敏,徐英.新生儿柯萨奇病毒感染死亡病例临床及病理分析[J].中国医科大学学报,1994(5):482-483.
[6]陈立,赵月萍,张礼璧,等.引发脑膜脑炎流行的柯萨奇B5病毒的序列分析[J].中国计划免疫,2003,9(2):94-97. DOI: 10.3969/j.issn.1006-916X.2003.02.009.
[7]葛琼,严菊英,龚黎明,等.浙江省2008年病毒性脑膜脑炎病原柯萨奇B组5型病毒VP_1区基因变异分析[J].中国疫苗和免疫,2010,16(1):38-43.
[8]MaH, HuangX, KangK, et al. Recombination in human coxsackievirus B5 strains that caused an outbreak of viral encephalitis in Henan, China[J]. Arch Virol, 2013,158(10):2169-2173. DOI: 10.1007/s00705-013-1709-4.
[9]王永全,吉彦莉,曲梅.北京地区与手足口病相关的非EV71、非CoxA16型肠道病毒的分子特征分析[J].国际病毒学杂志,2011,18(3):75-79. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2011.03.003.
[10]李云逸,陆菁,杨玉颖,等. 2008—2012年上海市急性弛缓性麻痹监测中非脊髓灰质炎肠道病毒的基因型分布[J].中华预防医学杂志, 2014,48(6):527-529.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.020.
[11]TamuraK, PetersonD, PetersonN, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol, 2011,28(10):2731-2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121.
[12]MartinDP, LemeyP, LottM, et al. RDP3: a flexible and fast computer program for analyzing recombination[J]. Bioinformatics, 2010,26(19):2462-2463. DOI: 10.1093/bioinformatics/btq467.
[13]DrummondAJ, SuchardMA, XieD, et al. Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7[J]. Mol Biol Evol, 2012,29(8):1969-1973. DOI: 10.1093/molbev/mss075.
[14]刘建生,邵聪文,赵卫中,等. 2009年云南省柯萨奇病毒B5分离株A210/KM/09全基因序列分析[J].中华流行病学杂志,2014,35(3):307-311. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2014.03.020.
[15]甘霖,滕峥,王嘉瑜,等. 2014年上海市手足口病的病原谱及EV-A71和CV-A16分子流行病学特征分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2016,30(3):286-292. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.008.