中华预防医学杂志    2018年02期 棘球绦虫的主要生理学特点与包虫病控制方法的确立    PDF     文章点击量:915    
中华预防医学杂志2018年02期
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李军 郭刚 张壮志 张文宝
LiJun,GuoGang,ZhangZhuangzhi,ZhangWenbao
棘球绦虫的主要生理学特点与包虫病控制方法的确立
Physiological characteristics of Echinococcus and their association with interventions against echinococcosis
中华预防医学杂志, 2018,52(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.02.019

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投稿日期: 2017-03-15
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棘球绦虫的主要生理学特点与包虫病控制方法的确立
李军 郭刚 张壮志 张文宝     
李军 830054 新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院,新疆重大疾病医学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地
郭刚 830054 新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院,新疆重大疾病医学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地
张壮志 新疆畜牧科学院兽医研究所
张文宝 830054 新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院,新疆重大疾病医学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地
摘要: 由细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫引起的棘球蚴病在全世界范围内流行,严重危害了人群的身体健康和社会发展。棘球绦虫生理学特点和生理指标是设计控制方案,解决诊断、治疗和预防等方面问题的基础。棘球绦虫有其复杂的生活史,需要寄生于两个哺乳类动物,经历不同发育的阶段(成虫、虫卵、包囊和原头蚴),每个阶段都有各自不同的生理学特点。本文系统总结和归纳了棘球绦虫主要生理学特点并强调了与控制方案有关的生理学参数。从生活史可以看出,棘球绦虫有两个感染阶段,一是虫卵,它是引起人和中间宿主原发性感染的唯一阶段;二是原头蚴,唯一感染犬等终末宿主的发育阶段。虫卵产生于寄生在终末宿主小肠里的成虫,虫卵在成虫体内的成熟时限是确定对犬驱虫间隔期的生理参数。细粒棘球绦虫在犬体内发育45 d产生发育成熟的虫卵。该期限是国外每年8次驱虫的基础。多房棘球绦虫在犬和狐狸体内感染28~30 d产生成熟的虫卵,控制泡球蚴的流行和传播,驱虫间隔期应该少于30 d。鉴于泡型包虫病和囊型包虫病在我国西部共流行,目前对犬每年12次驱虫,即成虫期前驱虫措施已经列入包虫病控制规划,广泛应用西部流行区。绵羊肝肺脏器内的包囊发育至成熟原头蚴需要12~15个月,采取羔羊上市的牧业生产方式因其羊体内的包囊不能产生原头蚴而成为囊型包虫病控制的有效方法。另外,棘球绦虫有其独特的生物学特点,比如有性繁殖和无性繁殖,包囊的单细胞层结构,胆盐调控原头蚴双向发育,包虫蚴在中间宿主体内长期感染的无症状反应等等,使其成为研究生物学和医学生物学问题的工具。囊蚴分泌的包囊液是研究诊断试剂的抗原来源,特异的六钩蚴表达基因是研制疫苗的重要发育阶段。随着高通量组学,包括基因组学、转录组学以及蛋白质组学的发展和应用,我们可以利用棘球绦虫的生理学特性寻找诊断试剂,研发预防疫苗和确定新型药靶。
关键词 :棘球绦虫;棘球蚴病;生理学;控制
Physiological characteristics of Echinococcus and their association with interventions against echinococcosis
LiJun,GuoGang,ZhangZhuangzhi,ZhangWenbao     
State Key Laboratory Incubation Base of Xinjiang Major Diseases Research, Clinical Medical Research Institute, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China
Corresponding author: Zhang Wenbao, Email: wenbaozhang2013@163.com
Abstract:Alveolar and cystic echinococcosis are important zoonotic diseases caused by the dog/fox tapeworms of Echinococcus granulosus and E. multilocularis, which are distributed in almost whole the world. The diseases remarkably impact on the people's health and economic development of communities. Echinococcus tapeworms need two mammalian animals to complete their lifecycle. The worms undergo different developmental stages (adult, egg/oncosphere, cyst, and protoscolex). Each stage has its own distinct physiological characteristics. We summarize the characteristics and emphasize that some features that strongly impact on design of control program. Based on the lifecycle of these worms, two stages are infectious, one is egg the only stage for primarily infecting humans and intermediate host, and another stage is protoscolex, the only stage for infecting the definite hosts of the worms. Eggs are produced by the adult worms parasitized in the intestine of definite hosts. It takes 45 days for eggs becoming mature in dogs. With this feature of the tapeworm, New Zealand and Tasmania in Australia designed control program for deworming 8 times annually with an interval between deworms at 45 days. E. multilocularis takes 28-30 days in dog/fox producing mature eggs. Given that co-existence of E. granulosus and E. multilocularis in western China, a control measure so called "prepatent deworming control measure" has been used in these endemic areas with dosing worms in dogs every month. It normally takes 12-15 months for producing protosocleces in E. granulosus cysts in sheep. If meat markets attract most lambs, that is an effective measure for controlling cystic echinococcosis given that there are no protoscoleces produced from those lambs. In addition, Echinococcus has its own unique biological characteristics, such as sexual reproduction and asexual reproduction, single-cell layer structure of cyst, bidirectional development of protoscoleces induced by bile salts, and long term of infection causing host asymptomatic reaction make the parasites a models for addressing some biological and biomedical issues. And more, hydatid cyst fluid is the antigen resource for identifying diagnostic reagents; the specific gene expressed in oncospheres has been developed as an effective vaccine used for control program. With the development and application of high-throughput omics, including genomics, transcriptomics and proteomics, we can use the physiological characteristics of Echinococcus for searching diagnostic reagents, developing preventive vaccines and identify new drug targets.
Key words :Echinococcus;Echinococcosis;Physiology;Intervention
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棘球蚴(包虫)病是一种世界范围内流行,危害严重的人兽共患病,对人群身体健康和社会经济发展带来较大影响。棘球蚴病的记载可以追溯到古代,医药之父——古希腊医师希波克拉底曾经这样描述棘球蚴病患者"In those whose water stuffed liver opens into the omentum, the belly is filled with water, and they die."(充满肝脏的液体流向腹网膜,导致病人腹水最终死亡)[1]。对人致病的棘球蚴病主要有两种类型:细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)引起的囊型棘球蚴病和多房棘球绦虫(E. multilocularis)引起的泡型棘球蚴病[2]。估计世界范围内囊型棘球蚴病和泡型棘球蚴病导致的伤残调整寿命年(disability adjusted life years, DALYs)分别为100万人年~300万人年和65万人年,疾病负担主要集中在中国西部地区,我国藏区群众棘球蚴病患病率甚至远远超过艾滋病和结核病。
        德国科学家Stunkard和Enigk[3]于1853年发现和证明了细粒棘球绦虫的生活史。10年之后,冰岛利用这一发现开始了针对病原宿主的控制,明确指出控制犬的数量,对犬驱虫和禁止给犬喂食家畜脏器是控制棘球蚴病有效的方法[4],这是生理学结果用于控制的典范。但150年过去了,全世界仅有冰岛和新西兰两个岛国有效控制并消除了棘球蚴病,其他国家仍然处于流行或高流行状态。棘球蚴病控制难的问题源于对棘球绦虫生物学认识的不足,尤其是针对病原生理学问题还没有充分掌握,加之影响其传播的因素极其复杂,限制了有效控制手段的研发。生理学是生物科学的一个分支,是研究生物机体的生命活动现象和规律以及机体各个组成部分功能的一门科学,在分子,细胞,组织,器官,个体及其生存环境等不同层面上对生命组成和功能进行揭示。本文主要从棘球绦虫主要生理学特点出发,阐述在棘球蚴病诊断、治疗和控制研究的应用。

一、不同发育阶段棘球绦虫的生理特点及控制方法确立  棘球绦虫需要两个哺乳类动物才能完成其生活史,成虫即绦虫期寄生于终末宿主犬科动物的小肠内,包囊幼虫则寄生在人、草食家畜或啮齿类动物(中间宿主)的以肝为主的实质性器官内。终末宿主和中间宿主寄生了不同的发育阶段虫体,不同的发育阶段有不同的形态结构。细粒棘球绦虫有四个标志性发育的阶段(图1),即成虫(终末宿主体内),虫卵(终末宿主体内)和六钩蚴(中间宿主体内),包囊(幼虫在中间宿主体内)和原头蚴(中间宿主体内)。

图1不同发育阶段的细粒棘球绦虫

(一)成虫期的主要生理特点与控制关系  相对于其他带科绦虫,棘球属绦虫成虫有以下几个明显的生理特点:(1)虫体小,仅有2~7 mm长;(2)节片数少,3~5节,细粒棘球绦虫由1个头节和3或4个体节(即幼节、成节和孕节)组成。这不同于许多其他带科绦虫由几十个到上百个节片组成,长度为几十厘米到几米长,比如在人肠道里寄生的猪带绦虫(Taenia solium)和牛带绦虫(T. saginata),寄生在犬小肠内的多头绦虫(T. multiceps)和泡状带绦虫(T. hydatigena),其长度都在1 m以上,牛带绦虫长度可达25 m;(3)终末宿主只是在犬科动物的小肠内寄生,表现为相对的宿主特异性[5];(4)在终末宿主体内可以大量荷虫,1只犬的小肠可寄生十几万条成虫。终末宿主大量地寄生成虫,并且成虫通过有性繁殖生产大量的虫卵,加之中绦期幼虫在中间宿主体内通过无性繁殖大量地生产原头蚴,这种有性加无性的繁殖方式保证了该虫种的延续。
        棘球绦虫成虫具有绦虫自身的典型特征,其中包括细长,扁平的虫体以适应肠道的寄生;自身缺乏肠道系统,新陈代谢产物只能通过体表完成,因而它可以作为膜转运机制研究以及寄生虫和宿主界面反应的模式生物;虫体的基本单位是节片,节片通过无性繁殖的方式连续不断地生产新的节片,成熟的体节拥有雌雄两套生殖器官,通过有性繁殖生产虫卵。所有节片均富含肌肉组织,伸缩力极强,成虫可缩至2 mm,可伸至10 mm。肌肉支配的伸缩运动是成虫在肠道内固着和移动的动力,失去肌肉的动力,成虫将很难在肠道内生存,因此成虫肌肉伸缩运动相关蛋白也是筛选药物和研制疫苗的靶蛋白。
        绦虫成虫头节略呈梨形,直径0.3 mm,有顶突和4个吸盘。顶突有两圈头钩,也叫吻钩,共28~48个(通常30~36个),两圈头钩呈放射状排列。顶突,头钩和吸盘可使虫体固着或吸附于宿主的肠黏膜上。顶突有发达的肌肉可伸缩,顶端有一群梭形细胞组成的顶突腺,腺体由糖原染色(periodic acid-schiff stain,PAS)阳性染色细胞构成,组织染色证明分泌的物质为可以消化宿主蛋白的脂蛋白[6]。成虫在有抗体的血清中培养,分泌物对抗体发生反应,提取的分泌物具有免疫原性,可以调节宿主的免疫反应。研究表明顶突分泌物与节片的生长和分化有关,其分泌蛋白可能是研制抗成虫疫苗的靶蛋白。
        尽管犬感染细粒棘球绦虫后,大多数可以测到成虫抗原的抗体[7],但绝大多数的犬感染细粒棘球绦虫后,在肠黏膜处没有严重的炎症反应,但局部体液和细胞免疫反应是存在的,这些反应说明肠道PP结(peyer patch)由于细粒棘球绦虫的感染而产生了特异性的抗感染免疫反应,并且分泌特异的免疫球蛋白A和免疫球蛋白G,但这些反应似乎与细粒棘球绦虫的寄生数量没有相关性[8]。关于细粒棘球绦虫寄生后的肠黏膜的局部免疫反应需要进一步的证实,这对于研制犬抗细粒棘球绦虫的疫苗至关重要。
        犬感染试验证明细粒棘球绦虫成虫生长45 d后发育成熟,也具有了感染力[9]。实际上这是新西兰、澳大利亚塔斯马尼亚州和阿根廷控制方案中每年8次驱虫的依据。该方案与严格的家畜屠宰管制结合,在新西兰和塔斯马尼亚州实现了对棘球蚴病的控制[4]。但在阿根廷,绵羊棘球蚴病感染率下降至5%~10%水平后便维持在这一状态,原因可能是这种"刚好"的驱虫间隔期依然会有具备感染力的虫体发育成熟。因此我们认为"犬犬投药,月月驱虫"的棘球蚴病防控措施是适合中国国情的方法[10]

(二)中绦期的主要生理特点与控制关系  细粒棘球绦虫中绦期(棘球蚴)的宿主种类较多,可寄生于人,有蹄类哺乳动物和啮齿类体内,表现为宿主的相对的广泛性。棘球蚴没有性器官,结构简单,在人类的脏器内生存可长达53年。棘球蚴一个重要的特点是包囊通过无性繁殖产生大量的原头蚴(原头蚴犬感染唯一的病原体)。当细胞结构富含多糖的角质层形成后,包囊便开始了持续的生长。一般直径每年增加0.5~1 cm。不同的宿主,其生长的速度和大小有所不同。比如在人体内包囊较大,包囊可达16~30 cm[11],而在5岁的绵羊中,较大的包囊为5~7 cm。在其他一些长寿的动物如马、牛等,包囊要大些。1个10 cm的包囊可生长87 920个生发囊,含有130万个原头蚴。感染小鼠体内10个月后,生发层细胞开始聚集,堆积成"肉芽",肉芽继续分化形成生发囊[12]。生发囊的顶端细胞通过堆积形成细胞团,然后这些细胞团分化、发育为一个原头蚴,这样一个生发囊可以连续不断的产生原头蚴,其数量为3~40个不等。
        棘球蚴能够在许多中间宿主的体内生存相当长的时间,表明该寄生虫具有产生缓解宿主免疫反应的能力,使其逃避来自于宿主的攻击[13]。抗原基因多态性是一个躲避策略,它有利于棘球蚴对哺乳动物中间宿主的入侵。基因组序列研究表明即使克隆的寄生虫,基因编码的外部跨膜蛋白和分泌蛋白(0.093%)比其他类基因(0.087%)更加多态性。分泌性蛋白AgB是细粒棘球绦虫所特有的,由至少10个基因组成的基因家族(AgB1-5)编码[14],它在免疫逃避过程中起到关键作用[15]。其他躲避策略包括产生与释放蛋白酶和蛋白酶抑制剂,蛋白质和避免宿主蛋白酶消化的作用。细粒棘球绦虫基因组中有1 965个带有信号肽的预测蛋白质,其中809个是细胞外的或分泌蛋白质,它们很可能在细粒棘球绦虫和其宿主间的"串扰"中起关键的信使作用,并且在调节宿主免疫反应中扮演重要的角色。细粒棘球绦虫原头蚴、包囊及成虫阶段可能会通过高表达的分泌产物[16],影响宿主免疫系统进而提供一种有利于自身生存的抗炎症环境。研究发现给犬每周注射一次地塞米松,感染犬体内原头蚴的成活率即每犬的荷虫数几乎高于非注射犬10倍以上。日本Kamiya教授曾经给长爪沙鼠和仓鼠注射免疫抑制剂,而成功使原头蚴在肠内发育成成虫。因此从免疫调节机制入手干扰绦虫的生长发育,可能也是治疗棘球蚴病的一种潜在可行方案。
        原头蚴从被终末宿主食入到定居需要30~120 min的时间,定居后进入向成虫的发育阶段。体内感染实验证明,86.5%的原头蚴在犬吞食6 h后外翻,外翻后的原头蚴出现了典型的成虫头节的形态及组织和器官,包括明显的4个吸盘,顶突和大小头钩30~35个。一般成虫寄生在十二指肠后40~120 cm的区域,外翻原头蚴如果不能在短时间内定居在小肠上,虫体将随粪便排出体外。因此,阻碍原头蚴的固着和定居也是研制犬抗成虫感染疫苗的一个思路。
        细粒棘球绦虫原头蚴具有双向发育特点,即可以发育为成虫,也可以发育为包囊幼虫。狗摄入原头蚴可以在肠道里发育为成虫,成为有性繁殖的成虫[17]。另一方面,如果一个原头蚴在中间宿主或人的器官中破裂,释放出的每一个原头蚴能够发育为一个新的包囊,该宿主成为棘球蚴病"继发性"感染患者。已被证明,胆汁酸在原头蚴向成虫发展过程中起到了至关重要的作用。原头蚴的双向发育是研究棘球绦虫关键调控基因和发育的关键点。

(三)虫卵和六钩蚴的主要生理特点与控制关系  细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫虫卵为圆形,直径为30~40 μm之间,从外向内有几层膜结构,最外层为卵黄体组成外膜(卵黄层),包裹着放射状花纹,颜色较深,角质层组成的卵壳,其厚度在5 μm之间,这层壳对虫卵起着保护作用,一般认为它由多边形小块组成,含有惰性角蛋白,这些小块由一种粘合物质相连。虫卵在光学显微镜下在其中央可以看到有3对小钩,因此,壳内的幼虫被称为六钩蚴(oncosphere)(图2)。除了6个钩外,六钩蚴含有腺体细胞,肌肉细胞,胚性细胞等细胞成分。

图2细粒棘球绦虫虫卵
细粒棘球绦虫虫卵对环境的变化具有很强的抵抗能力,可以适应很大范围的温度变化,在湿润的环境中可以耐受-40 ℃的气温,生活一年。一个带壳的虫卵,像未孵化的鸡蛋一样,处于休眠状态。当虫卵被绵羊等中间宿主吞下,在胃液和肠液的作用下,外壳可以被脱去,内部的六钩蚴得以释放,并在胆汁和胰蛋白酶的作用下,六钩蚴被激活。胃肠液对六钩蚴的激活并不是唯一的因素,有人曾直接种植到羊的肺脏,虫卵在没有胃肠液存在的情况下,一样被去壳激活并发育为包囊。用小鼠做模型,虫卵注射到肺部,腹腔或肝脏等器官内,虫卵照样被脱壳激活并发育为包囊。
        六钩蚴的运动被证明是穿越肠壁和血管壁的关键因素。也有人认为六钩蚴分泌蛋白酶,这些蛋白酶被称之为"穿刺酶"或"穿刺腺",是"破肠壁进血流"的关键[17]。但"穿刺腺"只是假设,目前为止还没有确定六钩蚴"破肠壁、进血流"是否是酶消化的作用。早在1863年,Krabbe发现激活的六钩蚴可以在几分钟之内穿过肠壁后进入静脉血管,在几小时内定位于肝和肺脏。肝是包虫寄生的最多的部位,约75%的细粒棘球绦虫包虫寄生在肝脏。第2个最易寄生的部位是肺脏,占20%。现在还不清楚为什么大多数细粒棘球绦虫的六钩蚴选择这两个器官定居。而其他绦虫,如多头绦虫的六钩蚴选择牛羊的大脑和小脑,而猪带绦虫选择皮下肌肉。六钩蚴一旦定居于某个器官,便进入了后六钩蚴(past-oncosphere)的发育阶段。一般1~2周,主要表现为六钩和肌肉退化,腔体、生发层和角质层的形成。如果六钩蚴在1 h内不能穿过肠壁就会死亡并被肠道的消化液消化。幼虫生长3~8 d,形成角质层,并且可见的包囊直径已发育为1 mm。早期的六钩蚴和幼囊是非常脆弱的,很容易被抗体介导的免疫反应杀伤,大多数六钩蚴和幼虫在最初的几天被杀死,这是研制疫苗的基础[18]

二、棘球绦虫分子生理学特点及控制方法确立  在分子生物学方面,最近用高通量组学,包括基因组学、转录组学完成了细粒棘球绦虫(E. granulosus)[16]和多房棘球绦虫(E. multilocularis)[19]全基因组的测序,并在此基础上完成了细粒棘球绦虫主要发育阶段转录组和蛋白组的测序。细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫分别有11 325和10 345个基因。有近8 500个细粒棘球绦虫基因与已经测定的物种有同源基因序列,说明这种寄生虫在生物进化过程中与其他生物的关联性和基因的共需性。另外有3 900个棘球绦虫的特异性基因,这些特有的基因可能在很大程度上决定了棘球绦虫特有的发育、生长、生存及形态的生理学独特性。从分子水平探讨与寄生虫繁殖相关的生理学特点将对现代寄生虫学的发展起到很大的推进作用。只有掌握相关特异基因、基因表达和基因功能及其与生理,尤其是与生殖生理的关系,才能更好地了解寄生虫的发育,尤其是性器官的发育、分化、成熟及性行为。另外,由于长期大面积的化学药物治疗,使得寄生虫有可能会产生抗药性,在分子水平干扰和破坏生殖发育相关生物过程或通络,是研制新药的一个途径。
        转录组测序表明细粒棘球绦虫共有8 942个基因转录表达,有近2 400个基因处于沉默状态[16]。从四个不同发育阶段的转录组水平可以看出,转录表达的基因数有较大的差异,成虫有7 724个基因表达,六钩蚴有3 811个基因表达,包囊生发层有6 976个基因表达,原头蚴有7 471个基因表达[16]。有3 240个基因在细粒棘球绦虫的各个阶段都表达。值得一提的是在阶段性发育中,一些高表达基因,尤其是特异基因占有很高的比例(图3),说明这些高表达基因和特异基因对虫体的阶段性发育起到重要的调控作用。转录组测序表明虫体发育四个阶段受特异表达的限制,这些少量的基因在这个转录组中占有很高的比例[16],说明它们在虫体发育阶段性上起到主要的作用,同时也为诊断试剂、药物和疫苗研制提供了基因谱靶向。

图3细粒棘球绦虫4个发育阶段上调基因和特异基因转录水平

三、结语  目前棘球蚴病的防治存在着诸多问题,例如在诊断方面,还没有可以被广泛接受的,用于大面积筛选的免疫诊断试剂盒;在治疗方面,还没有治疗棘球蚴病的特效药物;在控制方面,有限的控制手段很难解决疾病传播防控过程中所面临的各项问题。未来只有从分子、细胞、组织器官、个体及生态系统着手,对细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫生理学进行全面、系统性研究,才能获得对该寄生虫病原生理的深入理解,从而寻找到解决医学、药学、疫苗学等相关问题的途径,继而有效地控制和治疗棘球蚴病。

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