中华预防医学杂志    2018年04期 2015年浙江省HIV-1新重组型毒株分子亚型特征分析    PDF     文章点击量:68    
中华预防医学杂志2018年04期
中华医学会主办。
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范钦 张文君 杨介者 何林 丁晓贝 张佳峰
FanQin,ZhangWenjun,YangJiezhe,HeLin,DingXiaobei,ZhangJiafeng
2015年浙江省HIV-1新重组型毒株分子亚型特征分析
Characteristic analysis of molecular subtypes and recombinant structure of HIV-1 infection in Zhejiang Province, 2015
中华预防医学杂志, 2018,52(4)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.04.014

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投稿日期: 2017-06-26
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2015年浙江省HIV-1新重组型毒株分子亚型特征分析
范钦 张文君 杨介者 何林 丁晓贝 张佳峰     
范钦 310051 杭州,浙江省疾病预防控制中心艾滋病与性病预防控制所
张文君 310051 杭州,浙江省疾病预防控制中心艾滋病与性病预防控制所
杨介者 310051 杭州,浙江省疾病预防控制中心艾滋病与性病预防控制所
何林 310051 杭州,浙江省疾病预防控制中心艾滋病与性病预防控制所
丁晓贝 310051 杭州,浙江省疾病预防控制中心艾滋病与性病预防控制所
张佳峰 310051 杭州,浙江省疾病预防控制中心艾滋病与性病预防控制所
摘要: 目的  了解浙江省HIV-1新重组型毒株的分子亚型特征和重组结构。方法  于2015年4—6月,按照感染途径,采用分层随机抽样的方法抽取浙江省新报告的现住址为本省,且经实验室确诊、未接受抗病毒治疗的302例HIV感染者(不包括艾滋病患者)为调查对象。采用调查问卷收集调查对象的性别、户籍地、婚姻状况、传播途径和报告地区等信息。采集HIV感染者至少8 ml静脉血,运用RT-PCR和巢式PCR扩增感染者HIV-1毒株pol区基因序列,通过系统进化树筛选新流行重组型(CRF)毒株和独特重组型(URF)毒株,并对其进行分子亚型分析和重组分析。结果  302例感染者中,发现18例感染了新CRF毒株或URF毒株,其中男男性行为传播为15例(83.3%),异性性传播途径为3例(17.7%);感染新CRF毒株为8例(44.4%),分别是CRF55_01B亚型为5例(27.8%)、CRF67_01B亚型为2例(11.1%)和CRF69_01B亚型为1例(5.6%);感染URF毒株为10例(55.6%),其中6例在pol区序列为CRF01_AE亚型和CRF07_BC亚型组成的两段重组毒株,3例在pol区序列为该两种亚型组成的三段重组毒株,另外1例尚不能准确判断其重组结构。重组来源分析的结果显示,浙江省2015年新发现的重组毒株与广东、安徽、河北、云南、辽宁等省份检测发现的毒株有较高同源性,序列相似度为94.4%~98.0%。结论  浙江省新型重组毒株主要为CRF毒株和以CRF01_AE和CRF07_BC为重组结构模式的URF毒株,且均为外地流行传播引进,跨地区形成传播链。
关键词 :HIV-1;基因型;分子流行病学;重组结构
Characteristic analysis of molecular subtypes and recombinant structure of HIV-1 infection in Zhejiang Province, 2015
FanQin,ZhangWenjun,YangJiezhe,HeLin,DingXiaobei,ZhangJiafeng     
Department of HIV/AIDS and STDs Control and Prevention, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhuo 310051, China
Corresponding author:Zhang Jiafeng, Email: jfzhang@cdc.zj.cn
Abstract:Objective  To understand the molecular subtypes and recombinant structure of HIV-1 infection in Zhejiang Province.Methods  According to the method of stratified random sampling method, a total of 302 newly HIV infected people (excluding AIDS patients) were selected as the subjects of the investigation from April to June, 2015, who were all newly HIV positive patients reported in Zhejiang Province and were diagnosed as HIV positive and had not received antiretroviral treatment. Questionnaires were used to collect information such as gender, residency, marital status, route of transmission and case reporting area. At least 8 ml of venous blood was collected from HIV infected people, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and nested PCR were used to amplify the pol gene sequence of HIV-1 strains and circulating recombination forms (CRF) and unique recombinant form (URF) strains were screened using phylogenetic tree, and molecular subtype analysis and recombinant analysis were performed.Results  Of the 302 HIV infected people, 18 cases were infected with new CRFs or URFs, among which 15 were male (83.3%), 3 were heterosexual transmission (17.7%); 8 cases (44.4%) were infected with new CRFs, which included CRF55_01B 5(27.8%), CRF67_01B 2 (11.1%), CRF69_01B 1 (5.6%); 10 cases (55.6%) were infected with URFs, in which 6 cases were infected with two groups of recombinant strains composed of CRF01_AE subtype and CRF07_BC subtypes in pol region, 3 cases were infected with three groups of recombinant strains of the two subtypes in pol region, and 1 case could not be accurately determined of the recombinant structure. The results of recombinant source analysis showed that the newly recombinant strains found from Zhejiang province were highly homologous to the strains from Guangdong, Anhui, Hebei, Yunnan, Liaoning province, and the sequence similarity was 94.4%-98.0%.Conclusion  The new recombinant strains of Zhejiang province included CRFs strains and URFs strains with CRF01_AE and CRF07_BC as the main recombinant structure mode, and all of them were introduced from other places and formed a trans-regional chain of HIV transmission.
Key words :HIV-1;Genotype;Molecular epidemiology;Recombinant structure
全文

HIV-1是导致全球艾滋病流行的主要病原体,分为M、N、O、P组,其中M组在全球范围内广泛流行,而且产生了不同的基因亚型,主要包括A、B、C、D、F、G、H、J和K亚型,以及大量流行重组型(circulating recombination form,CRF)和独特重组型(unique recombinant form, URF)[1,2]。随着检测覆盖面的扩大,近几年也检测发现了部分HIV-1的新重组型毒株,包括新命名的CRF(如CRF55_01B、CRF59_01B和CRF67_01B等)及大量的URF,其中CRF55_01B和CRF59_01B亚型在男男性行为人群中被检测发现[3,4];CRF57_BC和CRF62_BC亚型在异性性传播人群和静脉吸毒人群中被检测发现[5,6];由CRF01_AE、B和(或)C亚型重组而成的URF在异性性传播人群、男男性行为人群和IDU中均有发现[2,7,8,9,10]。这些新重组毒株的出现以及流行传播,促使HIV-1基因多样性更加复杂,从而使艾滋病预防和控制工作面临更严峻的挑战。浙江省地处中国经济发达的长三角地区,毗邻上海、江苏、安徽、江西和福建等省市,人口流动频繁,所以HIV-1基因型种类复杂。浙江省于2015年开展了HIV分子流行病学调查,进一步了解HIV-1新重组型毒株的分子亚型特征,为浙江省HIV-1疾病预防及监测提供基础依据。

对象与方法  

1.对象:  于2015年4—6月在浙江省开展HIV分子流行病学调查,根据感染途径采用分层抽样方法,按男男性行为、异性传播及其他传播方式分3层,每层按照浙江省11个地市(杭州、宁波、温州、湖州、嘉兴、绍兴、衢州、金华、舟山、台州、丽水)HIV感染比例采用随机数字表法进行抽样,共选取302例HIV-1感染者作为调查对象。纳入标准:2015年4—6月新报告的现住址为浙江省,且经实验室确诊、未接受抗病毒治疗的HIV感染者(不包括艾滋病患者)。采用自制的调查问卷收集调查对象的年龄、职业、性别、户籍地、婚姻状况、传播途径和报告地区等信息。本研究通过了中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心伦理委员会审核(批号:X140617334),所有研究对象均已签署了知情同意书。

2.样本采集与保存:  使用10 ml EDTA抗凝管(美国BD公司)采集HIV感染者至少8 ml静脉血,颠倒8~10次后离心收集全血、血浆和淋巴细胞富积液,置-80 ℃冰箱保存备用。

3.核酸序列提取及测定:  取200 μl血浆样本,采用法国生物梅里埃公司的NucliSENS easyMAG核酸提取系统进行HIV RNA提取,以提取的RNA为模板,采用RT-PCR和巢式PCR的方法扩增HIV-1的pol区基因蛋白酶(全长)和逆转录酶区(前300个氨基酸位点),扩增产物大小为1 316 bp,具体方法参考文献[11]。最后将扩增产物送至杭州擎科梓熙生物科技有限公司进行纯化和测序。

4.序列亚型分析:  使用Sequencher 5.0软件对测序成功的序列进行校正和拼接,使用BioEdit 7.2.0软件对样本序列和国际参考序列(来自美国Los Alamos国家实验室HIV序列数据库)进行比对。用MEGA 5.0软件构建Neighbor-Joining系统进化树,确定HIV-1毒株亚型,判断标准为,构建的系统进化树中分簇的Bootstrap值≥90%,且与参考基因型平均遗传距离≤0.03。

5.序列重组分析:  (1)重组类型分析:通过系统进化树筛选出未能与已知的亚型或重组型毒株聚类的序列,考虑其为URF毒株,然后利用临近法(neighbor-joining,NJ)或者最大似然法(maximum likehood,MJ)构建URF毒株序列的系统进化树,采用美国Los Alamos国家实验室HIV序列数据库RIP重组分析工具分析重组类型,然后使用SimPlot3.5.1软件进一步进行重组断点分析[12,13]。(2)重组来源分析:选取序列亚型分析中判断为新重组型毒株的HIV-1 pol区序列分别与HIV BLAST比对,选取pol区基因相似度较高序列进行同源性分析,判断其重组起源。

结果  

1.基本情况:  在302例HIV感染者中,通过PCR扩增成功获得了276例感染者的HIV-1基因序列,其中CRF07_BC亚型为122例(44.2%),CRF01_AE亚型为103例(37.3%),其他亚型为51例(18.5%)。276例HIV-1感染者中,共发现18例HIV感染者感染了HIV-1新CRF毒株或URF毒株,其中浙江省户籍10例,外省户籍6例,分别包括山西省2例,辽宁省、湖北省、贵州省和山东省各1例,未知户籍2例;报告地区在杭州为7例,嘉兴为3例,温州为3例,台州为2例,金华为2例,绍兴为1例;男男性行为传播为15例,异性性行为传播为3例。详见表1

表1浙江省2015年感染新重组型HIV-1病例个案信息

2.亚型分析:  通过pol区基因序列测定,18例感染了HIV-1新CRF毒株或URF毒株者的样本全部测序成功。将所获取的18条pol区基因序列与来自目前国际流行的参考株和美国Los Alamos国家实验室HIV序列数据库中新发现的流行重组参考株进行比对,采用邻近法构建系统进化树(去掉与本研究序列同源性差异较大参考株序列)发现,8例可确定为CRF,其中5例与参考株CRF55_01B亚型集合成簇,1例与参考株CRF59_01B亚型集合成簇,2例与参考株CRF67_01B亚型集合成簇,Bootstrap值均>90%,且平均遗传距离均<0.03;另外10例与目前已知的国际参考株均未成簇,判断为URF。

3.重组分析:  通过SimPlot软件进一步分析,8例CRF与各自的参考株重组模式相同,重组断点相似,可确定为相应的CRF亚型。同时为了进一步了解另外10株URF毒株的重组结构,对该10株URF毒株进行重组断点分析,如重组结构示意图(图1)和重组断点一览表(表2)所示,其中9株为CRF01_AE亚型和CRF07_BC亚型的重组毒株。该9株URF毒株在pol区的重组断点均存在差异,其中HZ1510088、HZ20152245、JX20150462、TZ2015236、WZ150045和WZ150028均为CRF01_AE亚型和CRF07_BC亚型组成的两段重组毒株,详见图1A;HZ20152203、HZ20152163和SX20150328则是CRF01_AE亚型和CRF07_BC亚型组成的三段重组毒株,详见图1B,其中HZ20152203和HZ20152163的pol区均以CRF01_AE亚型为骨架,中间插入CRF07_BC亚型pol区的部分基因片段,而SX20150328的pol区以CRF07_BC亚型为骨架,中间插入了CRF01_AE亚型pol区的部分基因片段。

表2浙江省2015年独特重组型感染病例pol区序列重组断点表
图1浙江省2015年新重组型HIV-1基因pol区重组结构图

4.重组来源分析:  (1)CRF毒株重组来源分析:将8株CRF毒株与HIV BLAST比对发现,其中5株CRF55_01B亚型毒株形成传播簇,与首次发现的CRF55_01B亚型毒株中的10CN.HNCS102056(GenBank: JX574661)、11CN.GDDG325(GenBank: KF927151)和LS6179(GenBank: KT379795)的序列相似度为98%~99%;1株CRF59_01B与广东发现的CRF59_01B亚型毒株序列相似度为98%;2株CRF67_01B亚型毒株与上海地区发现的CRF67_01B亚型毒株序列相似度为98%。(2)URF毒株重组来源分析:将10株URF毒株与HIV BLAST比对发现,HZ1510088,WZ150045与2011年发现的1株安徽省HIV-1毒株2011.ANHUI.BB17(GenBank: KC183774)在pol区相似度为97%;HZ20152163与2012年发现的2株云南省HIV-1毒株DH12JJX04(GenBank: KF714441)和DH12S0005(GenBank: KR823252)在pol区相似度为94.4%;JX20150462,HZ20152245与2013年杭州地区发现的1株HIV-1毒株HZ130198(GenBank: KM258694)相似度均非常高,分别为95%和97.6%;SX20150328与2013年河北省发现的HIV-1毒株13HeB12535(GenBank: KX791570)以及2012年浙江省发现的ZJ12S0032(GenBank: KR823988)相似度均为98%;HZ20152203与2009年辽宁省发现的HIV-1毒株09LNA379(GenBank: JX960603)相似度均为96%;TZ2015236与2009年云南省发现的HIV-1毒株YN12721(GenBank: JQ898239)相似度均为97%;WZ150028与2003年泰国发现的MU2003(GenBank: DQ354122)相似度为95%。

讨论  本研究中,CRF55_01B、CRF59_01BC和CRF67_01B等新流行重组亚型均是在经男男同性性行为传播的人群中检测发现的,其中5株CRF55_01B毒株的报告地区分别为杭州、嘉兴、金华和台州,浙江省首次报道CRF55_01B亚型毒株是在2011年浙江省新报告的男男同性传播艾滋病患者中检测发现的[11],并且与Han等[3]于2012和2013年首次发现CRF55_01B亚型毒株高度同源,并形成一个传播簇,提示该5株CRF55_01B毒株与尚红团队发现的毒株来源于同一祖先,其流行跨度涉及湖南、浙江和广东等多个地域[14,15,16],提示CRF55_01B已在中国跨地区传播多年,主要集中在中国东南地区,形成小密度的流行传播事件;1株CRF59_01B亚型毒株与在中国其他地区发现的CRF59_01B亚型毒株同源性较高[4,17],提示目前CRF59_01B亚型毒株在中国的流行情况与CRF55_01B亚型相似;2株CRF67_01B亚型毒株与上海发现的CRF67_01B亚型毒株序列相似度较高[18],提示浙江省新发现的2株毒株与上海CRF67_01B亚型毒株存在传播关系,来源于同一传播事件。
        HIV-1的基因重组已经被广泛认知,而重组发生的必然条件是在一个流行地区至少同时存在两种流行基因型[16,17,18],目前浙江省HIV-1主要流行基因型以CRF01_AE和CRF07_BC亚型为主,符合重组发生的条件,然而为更好了解浙江省URF毒株的重组基因片段的来源,判断是否来自本区域流行基因型的重组或者由外来已流行重组毒株的引进,本研究中的10株URF毒株均与中国其他地区发现的URF毒株存在较高的同源性,且均分散在中国多个地区,提示浙江省发现的9株URF毒株均可能来自中国其他地区,且已流行传播多年并跨越多个地区,形成稳定的传播簇,而不是本地新形成的重组毒株,推测有可能已经形成新的流行重组型在人群中持续传播,其中1株URF毒株HZ20152171可以确定是CRF01_AE为骨架的毒株,但目前无法确定重组片段来源。另外通过本次分子流行病学调查的资料发现,在浙江发现的CRF毒株和URF毒株中感染途径以男男性行为为主,占83%(15株),异性性传播占17%(3株),这可能与男男同性传播人群近年来具有多性伴、无保护性行为等特点有关,容易引起HIV-1重组与传播[9,14]。通过本次研究,初步了解了浙江省近年出现的新型重组毒株的分子亚型特征和重组结构特征,发现浙江省新型重组毒株以男男同性性传播为主,均为外地流行传播引进,跨地区形成传播链等特点,因此加强对浙江省新型重组毒株的检测,及时了解国内外新发现的重组毒株的流行特征和重组结构,开展早期预防,对浙江省HIV疫情防控提供基础理论依据。

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