中华预防医学杂志    2018年04期 中国六省份水痘-带状疱疹病毒糖蛋白M、L基因特征分析    PDF     文章点击量:637    
中华预防医学杂志2018年04期
中华医学会主办。
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牟君杰 齐梦缘 李崇山 郑焕英 陈萌 周剑慧 何吉兰 许文波 许松涛 许晓光
MouJunjie,QiMengyuan,LiChongshan,ZhengHuanying,ChenMeng,ZhouJianhui,HeJilan,XuWenbo,XuSongtao,XuXiaoguang
中国六省份水痘-带状疱疹病毒糖蛋白M、L基因特征分析
Characterization analysis of gM, gL genes of varicella zoster virus in six provinces of China
中华预防医学杂志, 2018,52(4)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.04.016

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投稿日期: 2017-11-21
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中国六省份水痘-带状疱疹病毒糖蛋白M、L基因特征分析
牟君杰 齐梦缘 李崇山 郑焕英 陈萌 周剑慧 何吉兰 许文波 许松涛 许晓光     
牟君杰 116044 大连医科大学中西医结合研究院
齐梦缘 116044 大连医科大学中西医结合研究院
李崇山 上海市疾病预防控制中心卫生检验所
郑焕英 广东省疾病预防控制中心卫生检验所
陈萌 北京市疾病预防控制中心免疫所
周剑慧 吉林省疾病预防控制中心免疫所
何吉兰 四川省疾病预防控制中心微检所
许文波 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
许松涛 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
许晓光 116044 大连医科大学中西医结合研究院
摘要: 目的  分析水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白(g)M、L的基因特征。方法  依据国家科技重大专项中发热伴出疹症候群病毒性病原监测项目,以2007—2015年北京(1例)、上海(5例)、吉林(2例)、青海(1例)、广东(2例)、四川(1例)监测到的12例VZV疑似患者为研究对象,收集其疱疹液或咽拭子标本共12份。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定标本VZV阳性情况,采用PCR扩增VZV阳性标本以及国产水痘减毒活疫苗v-Oka-BK和进口水痘减毒活疫苗Varilrix-1的gM、gL基因序列片段,进行核苷酸序列测定和分析。采用BioEdit、MEGA 5.0软件,比对VZV阳性标本与疫苗株(v-Oka-BK、varilrix-1)以及GenBank的国外野毒株(41株)、亲本株(p-Oka)、疫苗株(v-Oka、varilrix、varivax)的核苷酸序列。结果  12份标本均为VZV阳性。与疫苗株和亲本株相比,1份阳性标本gM基因在86686位点发生碱基突变,并导致氨基酸突变,5份阳性标本在87844位点发生碱基突变,有30株国外野毒株在87844位点上也存在相同变异;1份阳性标本gL基因在101245位点发生碱基突变,并导致氨基酸突变,6份阳性标本在101624、101625、101625位点上均发生了碱基缺失,国外野毒株在这3个位点均发生相同变异。与疫苗株相比,12份VZV阳性标本gM的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.2%~100%和98.2%~100%,gL的分别为99.3%~100%和98.6%~100%;与41株国外野毒株相比,gM的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.3%~100%和98.5%~100%,gL的分别为99.1%~100%和98.6%~100%。基因亲缘性关系树分析显示,基于gM有7份VZV阳性标本与疫苗株及亲本株在同一分支上;基于gL,有12份VZV阳性标本均与疫苗株及亲本株在同一分支。结论  12份VZV阳性标本gM、gL基因序列高度保守,抗原性稳定,存在减毒位点可能。
关键词 :糖蛋白类;水痘疫苗;基因特征;水痘-带状疱疹病毒
Characterization analysis of gM, gL genes of varicella zoster virus in six provinces of China
MouJunjie,QiMengyuan,LiChongshan,ZhengHuanying,ChenMeng,ZhouJianhui,HeJilan,XuWenbo,XuSongtao,XuXiaoguang     
Institute of Integrative Medicine of Dalian Medical University, Dalian 116044, China
Corresponding author: Xu Songtao, Email:xsttz886@sina.com
Abstract:Objective  To analyze the genetic characterization of glycoprotein M(gM.),glycoprotein L(gL) of varicella zoster virus.Methods  According to the program of "Ministry of Science and Technology of China" , Based on the 12 suspected VZV patients monitored in Beijing (1 case), Shanghai (5 cases), Jilin (2 cases), Qinghai (1 case), Guangdong (2 case) and Sichuan (case) in 2007-2015. A total of 12 Vesicle fluid and throat swab samples were collected. Positive samples were identified by Agarose gel electrophoresis and two glycoprotein genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR). Nucleotide sequences were determined and analyzed by PCR amplification of VZV positive specimens V-OKA-BK of the domestic varicella attenuated live vaccine and the Varilrix-1 of the imported attenuated live vaccine. Nucleotide sequences of VZV positive specimens, vaccine strains (V-OKA-BK, varilrix-1) and GenBank foreign wild strains (41 strains), parent strains (P-oka), vaccine strains (V-oka, Varilrix, Varivax) were compared using BioEdit and MEGA 5.0.Results  12 specimens were VZV positive. Compared with the vaccine strains and the parent strains, the GM gene of 1 positive specimen had radical mutation at 86686 sites, which resulted in amino acid mutation, 5 positive specimens had base mutation at 87844 sites, and 30 strains of foreign wild strains had the same variation at 87 844 sites. 1 positive specimens of gL gene in 101245 sites had base mutation, and led to amino acid mutation, 6 positive specimens at 101624, 101625, 101626 sites had base of loss and the foreign wild strains in these 3 sites had the same variation. Compared with the vaccine strains, the nucleotide and amino acid homology of gM of 12 VZV positive specimens were 99.2%-100% and 98.2%-100%, respectively, and gL of those were 99.3%-100% and 98.6%-100%, respectively. Compared with 41 strains of foreign wild strains, homology of gM's nucleotides and amino acid were 99.3%-100% and 98.5%-100%, respectively; 99.1%-100% and 98.6%-100% for gL. The results of phylogenetic analysis showed that 7 VZV positive samples were on the same branch with 4 vaccine strains and p-oka strain. Based on gL, 12 VZV positive samples were on the same branch as the vaccine strains and p-oka strain.Conclusion  This study demonstrates that the genes of gM, gL are highly conserved and remain stable immunogen, which may be involved in the attenuation of VZV and need to be further researched.
Key words :Glycoprotein;Vaccine;Genetic characterization;Varicella zoster virus
全文

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)属疱疹病毒属,人类疱疹病毒3型,人是其唯一的自然宿主。VZV可引起水痘和带状疱疹两种疾病,原发感染引起水痘,通常表现为轻症自限性疾病,偶尔会出现严重的并发症[1,2]。初次感染水痘后,VZV潜伏在脊髓后跟神经节,在机体免疫力低下等情况可导致病毒再激活,发生带状疱疹[3]。VZV基因组在遗传上较稳定,目前普遍采用单核苷酸多态性方法对VZV分型,VZV共编码gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL、gM、gN等9种糖蛋白[4,5,6,7]
        目前,世界上多个国家包括中国在内使用水痘减毒活疫苗(v-Oka)预防水痘。由于水痘疫苗不能提供100%的保护,时有发生水痘相关病例、突破感染、二次传播[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。VZV糖蛋白与VZV的感染、复制、成熟以及疫苗的减毒等密切相关,因此在使用该疫苗的同时有必要对VZV的糖蛋白进行基因特征分析。本研究通过对中国VZV流行株及国内外水痘减毒活疫苗的糖蛋白gM、gL进行测序分析,并与GenBank数据库中检索到的全基因组序列进行比较,分析中国VZV糖蛋白gM、gL的基因特征,为水痘疫苗的免疫效果评估提供实验室依据。

标本与方法  

1.标本:  依据国家科技重大专项中发热伴出疹症候群病毒性病原监测项目[19],以2007—2015年北京(1例)、上海(5例)、吉林(2例)、青海(1例)、广东(2例)、四川(1例)监测到的12例VZV疑似患者为研究对象,收集其疱疹液或咽拭子标本共12份,编号分别为:BeiJing09-10、ShangHai07-10、ShangHai07-11、ShangHai07-22、ShangHai10-03、Shang Hai10-02、JiLin11-06、JiLin15-06、QingHai13-08、GuangDong08-04、GuangDong09-03、SiChuan09-09,其中疑似水痘病毒标本8份,疑似带状疱疹病毒标本4份。详见表1

表112份水痘-带状疱疹疑似病例标本基本情况

2.试剂:  国产水痘减毒活疫苗v-Oka-BK(长春百克生物科技股份有限公司),进口水痘减毒活疫苗Varilrix-1(英国葛兰素史克公司)。核酸提取试剂盒QIAamp?Viral DNA Mini kit(250)、核酸纯化试剂盒(美国Qiagen公司),PCR扩增试剂盒PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye plus)(日本Takara公司),引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

3.核酸提取及阳性标本鉴定:  (1)DNA提取:取以上处理过的标本悬液各140 μl置于1.5 ml灭菌离心管中,按照DNA试剂盒操作说明提取样本的病毒DNA。(2)PCR扩增:提取待测标本和进口水痘减毒活疫苗的核酸后,将12份VZV疑似标本及国产(v-Oka-BK)和进口(Varilrix-1)水痘减毒活疫苗用PCR扩增ORF22区447 bp的特异片段,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定是否为阳性标本[20],所用引物及条件:F 5'-GGGTTTTGTATGAGCGTTGG-3',R 5'-CCCCCGAGGTTCGTAATATC-3',95 ℃预变性2 min;95 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。

4.gM、gL基因片段扩增:  自行设计引物(表2)。PCR反应程序为:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。目的PCR产物送擎科测序公司进行测序。

表2水痘-带状疱疹糖蛋白M、L的PCR引物序列

5.数据分析:  序列资料以标准图形文件格式保存,采用Sequencher 5.0软件进行序列整理。将本研究所测的疫苗株(v-Oka-BK、Varilrix-1)和VZV阳性标本与GenBank亲本株(p-Oka)、疫苗株(v-Oka、varilrix、varivax)以及已报道的41株国外野毒株(包括1株Dumas参考株)核苷酸序列,用Bio-Edit、MEGA 5.0软件进行序列比对及核苷酸与氨基酸同源性分析,用邻接法构建基因亲缘关系进化树。

结果  

1.标本鉴定结果:  经鉴定12份标本及国产(v-Oka-BK)和进口(Varilrix-1)水痘减毒活疫苗在400~500 bp处均有特异性条带,12份标本均为VZV阳性标本。

2.变异位点分析结果:  (1)gM:与疫苗株v-Oka、varilrix、varivax、varilrix-1,亲本株p-Oka相比,在86686位,ShangHai07-11发生G→A碱基突变,并导致Thr→Ala氨基酸突变;在87844位,GuangDong08-04、GuangDong09-03、BeiJing09-10、SiChuan09-09、QingHai13-08发生T→C碱基突变,有30株国外野毒株在此位点也存在相同变异。(2)gL:与疫苗株v-Oka、varilrix、varivax、v-Oka-BK、varilrix-1,亲本株p-Oka相比,在101245位点,BeiJing09-10发生A→G碱基突变,并导致Glu→Gly氨基酸突变;在101624、101625、101626位GuangDong08-04、BeiJing 09-10、GuangDong09-03、SiChuan09-09、QingHai13-08、JiLin15-06分别发生了碱基缺失,41株国外野毒株在这3个位点也有相同变异。详见图1

图112份VZV阳性标本与亲本株、疫苗株以及国外野毒株糖蛋白M、L核苷酸变异位点比较

3.同源性分析结果:  与疫苗株v-Oka、varilrix、varivax、v-Oka-BK、varilrix-1相比,12份VZV阳性标本gM的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.2%~100%和98.2%~100%,gL的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.3%~100%和98.6%~100%;与41株国外野毒株相比,gM的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.3%~100%和98.5%~100%,gL的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.1%~100%和98.6%~100%。

4.核苷酸序列系统进化树分析结果:  (1)gM:JiLin11-06、ShangHai07-10、JiLin15-06、ShangHai07-11、ShangHai07-22、ShangHai10-02、ShangHai10-03株与疫苗株v-Oka、varilrix-1、varilrix、varivax,亲本株p-Oka均在同一分支,具有较近的亲缘性关系;BeiJing09-10、GuangDong09-03、SiChuan09-09、JiLin11-06、QingHai13-08株与疫苗株v-Oka-BK以及Dumas参比株均具有较近的亲缘性关系。(2)gL:12份VZV阳性标本均与疫苗株v-Oka、varilrix、varivax、v-Oka-BK、varilrix-1,亲本株p-Oka在同一分支,具有较近的亲缘性关系,但与Dumas参比株不在同一分支。

讨论  接种疫苗是预防和控制水痘传播的最主要途径,目前我国市场上存在4个厂家的国产疫苗,所使用的毒株均为日本Biken研究院的Oka减毒株。根据美国在水痘爆发中的流行病学观察,未接种疫苗者的发病率为76.9%,接种疫苗者的发病率为11.8%,预防各型水痘的疫苗效力(vaccine efficacy,VE)为84.7%;预防轻至重型水痘的VE为97.6%[21],在免疫覆盖率高达96%的学生中爆发水痘时,水痘发病率为12%,可能与原发性免疫失败或继发性免疫失败有关,但症状甚轻;而未免疫儿童的发病率为43%,VE为72%。根据中国部分省市的流行病学监测数据统计发现,水痘的突破病例可达到40%左右[22,23]。WHO早已建议在一些水痘负担相对较重的国家和地区将水痘疫苗纳入免疫规划。然而,我国尚未将水痘疫苗纳入常规的计划免疫,接种率仅为40%~70%。水痘疫苗也面临着突破病例、疫苗相关病例、二次感染等严峻挑战。与此同时,欧美等多个国家已实行普种2针剂疫苗加强对水痘的预防控制。数据显示,2针剂疫苗提高VE的同时,也使突破病例减低1/3,并维持机体长久高效免疫[24,25],推荐水痘流行负担较重的区域实行两剂次接种策略,最大程度降低水痘突破病例,提高群体免疫力。
        目前,研究者们对水痘减毒活疫苗的减毒机制尚未完全清楚,但也有相关研究显示ORF62编码的早期调控蛋白62(IE62)在疫苗减毒中起关键作用,ORF62区发生氨基酸突变将影响病毒在细胞中的增殖与分化。VZV的可变区(R区)及仅在疫苗株中出现ORF0终止密码子的后移,也可能影响VZV的减毒[21]。对糖蛋白的研究主要集中在病毒感染表达最多的gE,其一个氨基酸的替换就可导致VZV复制的加快,gE在病毒正常繁殖及神经元间传播起重要作用[26]。表达量第二且具有免疫原性的糖蛋白gB,对病毒的吸附和穿透起重要作用[27]。gC的表达水平决定VZV的株型,v-Oka的gC表达量比野毒株低得多[28]。迄今国内外有关VZV糖蛋白gE、gB、gC的研究较多,关于gM、gL的报道相对较少。
        本研究结果发现,在gM、gL中各有一个重要的变异位点:与疫苗株相比,在87844位(gM),共5份标本发生T→G碱基突变,且v-Oka-BK疫苗株与36株国外野毒株在此位点上也有同样的变异;在101245位点(gL)BeiJing09-10发生由A→G碱基突变。值得注意的是101331位,38株国外野毒株在此位点上发生T→G碱基突变,86620位18株国外野毒株在此位点发生G→A碱基突变,并导致Thr→Ala氨基酸突变。需要说明的是101624、101625、101626位连续位点各有48株国内外的毒株发生碱基缺失,如果出现因基因突变导致氨基酸的改变,氨基酸变异引起的功能改变也有很大差异,除了功能以外,变异还可能以不同的方式影响蛋白质的其他特性,且关键位点的氨基酸变异可引起抗原性发生改变,因此氨基酸变异特征分析及以上提出的变异位点分析需要进一步开展研究。因预防水痘的疫苗是通过减毒作用获得,迄今对Oka疫苗得以减毒的分子机制尚未阐明,此前也没有相关文献对VZV的gM、gL基因特征作出相应报道,在今后的疫苗研制过程中是否需要注意以上内容值得深入探讨。对VZV核苷酸/氨基酸同源性分析发现其核苷酸/氨基酸同源性较高(>98.2%),表明gM、gL相对保守,抗原性稳定,通过分析亲缘性关系树总结得出,本研究测定的12株阳性标本与疫苗株具有较近的亲缘性关系。

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