中华预防医学杂志    2018年04期 细菌耐药机制：内源活性氧分子的角色    PDF     文章点击量：67    
中华预防医学杂志2018年04期
中华医学会主办。
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李欣 钟永亮 冯友军
LiXin,ZhongYongliang,FengYoujun
细菌耐药机制：内源活性氧分子的角色
Transformation of endogenous reactive oxygen species participates into bacterial antibiotic resistance
中华预防医学杂志, 2018,52（4）
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253.9624.2018.04.022

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投稿日期: 2017-11-29
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细菌耐药机制：内源活性氧分子的角色
李欣 钟永亮 冯友军     
李欣 471023　洛阳，河南科技大学食品与生物工程学院
钟永亮 471023　洛阳，河南科技大学食品与生物工程学院
冯友军 浙江大学医学院/动物科学学院
收稿日期: 2017-11-29
通信作者：冯友军，Email：fengyj@zju.edu.cn
摘要: 近年来，细菌耐药现象日渐严重，给抗感染治疗带来重大挑战。携带MCR-1/2或NDM-1等耐药基因的超级细菌的出现，使共性耐药机制的研究迫在眉睫。各类抗生素均诱导细菌代谢的变化，促进活性氧的产生，这些活性氧的水平及过氧化氢等分子的转化方向，决定了活性氧的作用是促进细菌损伤乃至死亡，亦或是诱导突变导致细菌耐药性的产生。本文讨论了抗生素诱导的活性氧的产生、转化及其对耐药发生发展的贡献，并阐述了抗生素诱导形成的间体膜囊通过携带大量过氧化氢外排，使细菌实现耐药的新途径。我们对活性氧参与细菌耐药机制的阐明，将提高抗生素处理的有效性，并为开发新的抗菌药物提供策略。
关键词 :抗生素;活性氧;过氧化氢;间体;耐药
Transformation of endogenous reactive oxygen species participates into bacterial antibiotic resistance
LiXin,ZhongYongliang,FengYoujun     
College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China
Corresponding author: Feng Youjun, Email: fengyj@zju.edu.cn
Abstract:A growing body of diversified antibiotic resistances raises a significant challenge to anti-infection clinical therapeutics. The emergence of superbugs carrying MCR-1/2 or NDM-1 determinants underlines the importance and urgency in elucidation of molecular mechanisms shared by antibiotic resistances. It is aware that different classes of bactericidal antibiotics consistently stimulate the production of deleterious reactive oxygen species (ROS), which are accompanied with metabolic disturbance. The different destinations of ROS determine its consequence on bacterial fate. Here, we review antibiotic-induced production, progression and transformation of ROS, as well as its role in the development of antibiotic resistance. Additionally, we anticipate that mesosome-like structures-aided exclusion of hydrogen peroxide might represent a previously-unknown mechanism for antibiotic resistance. This mini-review is aiming to present an update overview on antibiotic resistance and provide clues to the development of novel antibiotics.
Key words :Antibiotic resistance;Reactive oxygen species;Hydrogen peroxide;Mesosome-like structures;Drug resistance
全文

抗生素在临床的广泛应用大大降低了人类和动物细菌感染性疾病的发病率和死亡率，但由于抗生素的不规范使用和过度使用，抗生素耐药性出现的速度越来越快，感染的预防和控制越来越难[1,2]。能够对抗几乎所有单独或者联用的抗生素治疗方案的MCR-1、NDM-1等超级细菌的出现，是一个全球性的临床威胁，使共性耐药机制的研究迫在眉睫[3,4,5,6]。
        已发现的耐药微生物能够灵活的逃避多种结构和功能迥异的抗生素类型，在抗生素的选择性压力下细菌为了生存可通过产酶、外排泵、靶目标的改变等多种耐药机制与抗生素对抗[7,8,9,10,11,12]。随着耐药机制研究的日益深入，人们逐渐发现，虽然各种抗生素的靶目标不同，但活性氧（ROS）的产生很可能是目前各类型抗生素杀菌的共通机制。细菌对ROS代谢的调控很大程度上影响了抗生素杀菌的有效性，也体现了细菌的耐药性。
        本文讨论了抗生素处理诱导细菌产生氧化胁迫的机制，以及ROS在细菌耐药机制中的作用。此外，阐述了细菌间体膜囊外排H2O2从而诱导细菌耐药的新途径。对微生物药物胁迫反应和防御体系的系统性考察，将有助于找到新的抗菌策略，并为开发新的抗菌药物提供理论支持[13]。

一、ROS的产生  在富氧环境中，有机体活细胞中ROS是作为呼吸的副产物产生的，包括超氧阴离子（O2-·）、H2O2以及高破坏性的·OH。环境中的O2能够快速扩散进入菌体，并与众多生物分子反应。O2与呼吸黄素酶等生物分子的反应对ROS的产生尤为重要。呼吸黄素酶的活性位点含有易催化的氧化还原辅因子，能够快速参与O2的电子传递反应，从而产生O2-·和H2O2。
        一般认为，细胞内源ROS是主要来源于质膜或线粒体膜上的呼吸链氧化还原酶复合物。研究已显示，呼吸链能够产生生物学水平的O2-·[14]，但不能产生H2O2[15]。进一步研究发现，胞内O2-·和H2O2均主要来源于呼吸链之外的黄素蛋白的自氧化作用[16]。文献证实，氧化胁迫中内源ROS具有致突变的作用[17]。细菌清除ROS的抗氧化酶的作用机制研究也支持此论点[18]。众多ROS研究者已将工作聚集于ROS在细菌耐药机制中的作用。

二、ROS在细菌耐药中的作用  众多研究已经报道，虽然抗生素的靶目标不同，包括膜或壁的合成、蛋白质合成或DNA复制的抑制等，但几类抗生素都诱导细菌细胞中产生大量ROS[19,20]。Foti等[21]研究指出，虽然抗生素能够通过直接抑制上述靶物质阻碍细菌生长，他们更关键的致死作用在于间接的ROS产生，而不依赖于细菌DNA的损伤。细菌对ROS代谢的调控在很大程度上影响了抗生素杀菌的有效性，也体现了细菌的耐药性[22]。
        迄今为止，已有多篇论文阐述了ROS在抗生素信号网络中的作用[23,24]。经典的抗生素可通过刺激ROS的形成来杀伤细菌[25,26]。鲍曼不动杆菌Fe-S骨架蛋白NfuA可作为毒力因子，参与铁硫簇的形成并在细胞对铁的螯合和氧化胁迫的反应中起作用[27]。ROS的损伤增强了利福平和甲硝哒唑对大肠杆菌的杀伤作用[28]；反之，有氧呼吸的抑制能够降低大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性[29]，TCA循环代谢和呼吸链组分的突变也降低了妥布霉素对绿脓杆菌的杀伤作用[30]。
        在ROS介导的抗生素诱导细菌死亡途径的共通反应机制中，由H2O2经Fenton反应转化而成的大量持续性的·OH是杀伤细胞的直接原因[31,32]。Dwyer等[33]的研究显示，导致细菌死亡的·OH的产生过程中，存在TCA循环代谢、NADH的短暂消耗，以及铁硫簇的失衡以及铁离子的失控。更明确的是，抑制螺旋酶的抗生素处理激活了SoxR调控的O2-·胁迫反应[34]，修复/合成严重退化的铁硫簇的IscR调控的iscRUSA操作子[35]，Fur调控的铁离子内流和利用[36]，及SOS DNA胁迫反应[37]。体内实验已证实，这些反应推动了Fenton反应催化的·OH产生，在atpC (ATP合成酶的结构和质子转运组分)和iscS (上述IscR调控的铁硫簇合成结构的组分)的调控下[15]，这些高破坏性的·OH在诺氟沙星的杀菌效应中具有关键作用[33]。
        通过抗氧化系统的调控，众多研究者获得了ROS参与抗生素杀菌的进一步证据。Wang和Zhao[38]发现超氧化物歧化酶SodA and SodB的联合活性在氟喹诺酮杀菌过程中具有关键作用，而烷基过氧化物还原酶AhpC在β-内酰胺和氨基糖苷杀菌过程中具有关键作用。干扰抗氧化防御反应的多条途径，都能够产生更多的ROS，并增加庆大霉素的杀菌效率[39]。被1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐激活的SoxRS反过来诱导AcrAB-TolC多重耐药(multi-drug resistance, MDR)外排泵的表达，从而证实多重耐药外排泵的作用机制也有ROS的参与[40]。因此，抗氧化基因的缺失提高了抗生素敏感性，进一步证明由抗生素诱导产生的ROS在抗生素杀菌中具有重要的作用[28,29,30]。此外，双组分系统广泛参与了杀菌抗生素介导的氧化胁迫和细胞死亡，为杀菌抗生素诱导的杀菌共通机制提供了进一步的证据[15]。
        综上所述，众多的研究已经开始建立胁迫对抗稳态条件过程中的细菌ROS产生机制。一方面，ROS的水平应对其在抗生素杀菌过程中的作用具有重要意义，高浓度的ROS可促进抗生素的杀菌作用，而低浓度的ROS可通过诱导细菌突变，从而产生耐药性。另一方面，研究者们已注意到，已有证据中抗生素参与最多的ROS分子是最容易从O2获得电子的O2-·和最直接损伤细胞组分的·OH，而H2O2的寿命较长，与其他关键ROS分子O2-·和·OH的转化也较为复杂，其作用很难确认。胞内ROS的组成及氧化平衡状态受SOD等抗氧化酶系、铁离子等诸多因素的调控，ROS对细菌耐药的作用是一个相当复杂的问题。

三、ROS的转化影响细菌耐药性的形成  与能够被超氧化物歧化酶及过氧化氢酶/过氧化物酶等抗氧化酶催化清除的O2-·和H2O2不同，催化·OH细胞脱毒反应的酶尚不清楚。·OH能够随机的攻击蛋白、脂质和DNA，从而具有毒性或致突变性[41]。体内·OH通过H2O2氧化胞质溶液中自由的Fe2+的Fenton反应产生。Fenton反应与Fe3+被O2-·还原产生Fe2+的Haber-Weiss反应是相互依赖的。需要注意的是，O2-·需要与自由Fe3+反应，否则会攻击含铁硫簇的酶，从而释放出Fenton反应所需的Fe2+[42]。
        正因为如此，氧化胁迫过程中，O2-·在细胞膜上由呼吸链产生，被超氧化物歧化酶歧化生成H2O2或由Haber-Weiss反应还原Fe3+。接下来H2O2通过Fenton反应氧化Fe2+从而产生·OH和Fe3+，由此建立了ROS攻击生物分子又重新产生的快速反应的氧化还原循环。由于Fe2+能够定位于DNA、蛋白和脂质，产生的·OH就可以非常接近这些生物分子，并产生毒性作用[43,44]。
        与其他ROS相比，H2O2是更稳定的化合物，可由O2-·歧化产生，具有细胞毒性及信号传导、调控基因表达等多种重要的生理病理功能[45,46]。大肠杆菌在被暴露于毫摩尔级浓度H2O2达15分钟后仍有70%可存活。但这些H2O2被大量转化为·OH时，1分钟内存活率下降至低于0.1% [47]。因此，H2O2的含量应不是细菌损伤的关键，关键在于H2O2是否会继续生成·OH。H2O2到·OH的转化程度，对细菌的抗损伤能力具有重要的意义。
        Liu和Imlay等[48]研究发现，大肠杆菌H2O2清除酶缺失的突变体对抗生素的敏感性并不高于野生型菌株，因此提出ROS可能并不参与抗生素的杀菌机制。Keren等[49]的结果也证实，H2O2的水平并不能决定抗生素的杀菌能力。此外，也有报道指出，虽然氧化应激被认为是杀菌抗生素杀死细菌的机制之一，但ROS的形成可能在细菌杀伤和存活中起着不同的作用。万古霉素诱导的低浓度ROS形成可能甚至对异质性万古霉素中介敏感的金黄色葡萄球菌(heterogeneous vancomycin resistant S.aureus, hVRSA)菌株存活有益。而万古霉素敏感(vancomycin susceptible S.aureus, VSSA)菌株似乎不能诱导ROS形成。表明抗生素并不一定引起细菌的氧化应激，杀菌抗生素的杀伤作用并不总是依赖于ROS [50]。然而，与此相悖的是，Dwyer等[20, 51]认为ROS对细菌的损伤是抗生素杀菌的关键机制，且与细菌的呼吸代谢密切相关。
        Liu和Imlay[48]使用的是非常早期的对数期细胞，而Dwyer等[33]实验中的细胞生长浓度更高，Wang等[39]的研究也得出了相同结论。由于不同生长期细菌内CAT、AHP等抗氧化酶的表达不同，导致细菌对抗生素的反应表现出显著的差异。另一个可能的解释则是，抗生素使细胞中产生的大量H2O2在某种情况下并未用于损伤细胞，除已知的被CAT等抗氧化酶降解为H2O，这些H2O2极有可能有未知的代谢途径，避免其大量转化为·OH，从而使细菌产生耐药性。

四、细菌耐药中的膜囊泡间体与H2O2  本实验室在前期工作中发现，H2O2除转化为·OH和降解为H2O外，还存在一个新的代谢途径：细菌独特的膜结构-间体，可大量聚集细胞受损时产生的H2O2，并将其外排至胞外[52,53]。可极大程度的避免H2O2被转化为·OH。间体是细菌中的独特膜结构，在革兰阳性和阴性细菌中都存在，在染色体复制和分离、细胞分裂和细胞外酶的转运等多种细胞生理进程中起到重要的作用[54]。
        其他研究者与本实验室的结果均证实，间体在细胞正常状态下并不存在，重要的细胞事件（分裂或损伤）将诱导间体形成[54,57]。根据抗生素损伤细菌的机制不同，间体的形成有显著的差异[55,56,57]。片叶苔素C衍生物处理金黄色葡萄球菌及枯草杆菌后，透射电子显微镜下均观察到了耐药菌株胞内间体的形成，扫描电镜下观察到了间体膜囊的外排[58]。结果显示胞内间体形成后，细菌对抗生素的敏感性降低[58]，强烈暗示间体形成是细菌的自我保护机制。
        本实验室之前在对大肠杆菌内源H2O2功能的研究中发现，在受抗生素损伤的细胞中具有H2O2的额外大量产生，更令人感兴趣的是，细胞中出现特有膜结构-间体的形成，成为H2O2的额外大量聚集的位点，并且能够携带聚集的大量H2O2外排出胞外（图1）。细胞中这种额外的H2O2的聚集以及时间和空间定位的变化，与损伤程度和时间进程密切相关[52,53, 59,60]。且针对不同类型的抗生素，间体聚集H2O2外排的时间段也有显著不同。间体聚集H2O2外排应在细菌耐药机制中具有重要的意义。

图1利福平处理后大肠杆菌内源H2O2积累于间体膜囊并被外排出胞外
图选项
细菌内源的H2O2的代谢应存在3个主要方向：（1）在间体中聚集并被外排，此过程是细胞受损后的早期行为，能够在一定范围内避免ROS对细胞的损伤；（2）被上调表达的CAT、AHP等抗氧化酶降解；（3）余下的H2O2将在Fe2+存在下由Fenton反应转化为·OH，从而引起细菌DNA、质膜损伤，乃至细胞死亡（图2）。其中，间体聚集H2O2外排是细胞早期行为，很可能是细菌完成耐药的重要步骤。
图2H2O2转化方向模式图
图选项

五、结论与展望  1929年，Fleming[61]发表了关于青霉素的研究结果，开启了抗生素理论的新纪元。截至今日，单一及多重耐药细菌的不断出现，已经成为最为重要的社会问题。50年以来，抗生素耐药性的研究已阐明了哪些细菌可以改变抗生素的结构，阻断抗生素与其靶目标的相互作用，或者改变抗生素转运系统的有效性从而减少抗生素进入胞内[10,11]。最新的研究聚焦于明确细菌对抗生素的生理反应，从而掌握抑制耐药性增强和扩散的关键策略。
        由于抗生素诱导产生的ROS参与细菌耐药，大量研究尝试明确ROS的功能以及抗生素处理后细胞死亡过程中的氧化胁迫反应。本实验室虽已发现间体聚集H2O2并及时外排是细菌耐药的一条新途径，但抗生素压力下大肠杆菌产生的大量H2O2如何进入间体膜囊？间体膜囊如何形成？间体参与的细菌耐药机制尚有诸多疑问亟待解决。笔者推测，抗生素诱导细菌产生大量ROS，从而达到杀菌的目的。而细菌诱导间体形成，将H2O2等ROS排出胞外，从而达到细菌耐药的目的。在一定的抗生素浓度范围内，细菌与抗生素很可能在ROS代谢中存在博弈平衡。
        随着ROS参与细菌耐药机制研究的深入，未来将有可能从氧化胁迫反应的角度优化已有的抗菌策略，例如以间体为切入点可能发现打破抗生素与细菌的博弈平衡的方法，采用噬菌体基因工程过表达SoxR从而增强抗生素的致死率[62]，也能够帮助鉴定微生物防御系统中的新的靶目标，SOS反应在对抗已有的抗生素耐药性以及阻止耐药菌的进一步发展中具有巨大的潜力[13]。这些ROS相关调控机制的研究，都为进一步提高现有抗生素的有效性提供了有力的理论支持，也为新的抗生素的开发提供依据。

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