中华预防医学杂志    2018年05期 诱导性ppp2r1a基因敲除小鼠模型的表型和机制研究    PDF     文章点击量:41    
中华预防医学杂志2018年05期
中华医学会主办。
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樊俊灵 王方萍 王珊 柳晓玲 吴小嫩 陈雯 陈丽萍 李文学
FanJunling,WangFangping,WangShan,LiuXiaoling,WuXiaonen,ChenWen,ChenLiping,LiWenxue
诱导性ppp2r1a基因敲除小鼠模型的表型和机制研究
Phenotype and mechanism of inducible ppp2r1a knockout mouse model
中华预防医学杂志, 2018,52(5)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.05.013

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投稿日期: 2017-11-20
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诱导性ppp2r1a基因敲除小鼠模型的表型和机制研究
樊俊灵 王方萍 王珊 柳晓玲 吴小嫩 陈雯 陈丽萍 李文学     
樊俊灵 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系 广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
王方萍 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系 广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
王珊 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系 广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
柳晓玲 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系 广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
吴小嫩 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系 广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
陈雯 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系 广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
陈丽萍 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系 广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
李文学 广州市疾病预防控制中心毒理学检验部
摘要: 目的  研究诱导性ppp2r1a基因全身敲除对成年小鼠的主要生理功能影响并探讨相关机制。方法  将ppp2r1aflox/flox小鼠和CAGG-CreER小鼠杂交繁殖,获得20只CAGG-CreER ppp2r1aflox/flox小鼠,设立为纯合子组,并同时选取同窝野生型小鼠20只,采用单纯随机法,将纯合子、野生型小鼠分别分为4组,共8组,每组5只,腹腔注射他莫昔芬0、2、4、6 d,建立ppp2r1a基因诱导性敲除小鼠模型。采用Western blot法检测主要脏器中PP2A Aα(由ppp2r1a基因编码)的敲除效率,并观察小鼠体重、脏器病理改变以及外周血细胞计数和血生化,采用Real-time PCR法检测肝脏糖脂代谢相关基因的表达改变。结果  他莫昔芬注射6 d后,小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑的PP2A Aα敲除效率分别约为35%、12%、15%、60%、69%和72%。他莫昔芬注射6 d后,纯合子小鼠体重[(17.42±1.76)g]低于野生型小鼠[(21.69±1.82)g](P<0.05)。纯合子小鼠活动减少,腹部和肾周脂肪少,存活不超过7 d。第6天后,纯合子小鼠脾脏的脏器系数[(0.36±0.05)%]低于野生型小鼠[(0.59±0.10)%](P<0.05),组织病理HE染色显示脾脏萎缩明显,有核细胞明显减少。Tunel染色发现脾脏中淋巴细胞凋亡增多。纯合子小鼠血浆中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平[(153.68±62.80)U/L和(193.2±44.28)U/L]均高于野生型小鼠[(41.02±12.91)U/L和(69.40±9.55) U/L](P值均<0.05),提示ppp2r1a敲除导致肝损伤。纯合子血糖水平[(4.20±1.99)mmol/L]低于野生型[(8.88±0.65)mmol/L](P<0.05),而总胆固醇、HDL-C和β-羟基丁酸(β-HB)水平[(3.12±0.39)、(1.53±0.38)和(2.49±0.89)mmol/L]均高于野生型小鼠[(1.69±0.92)、(0.78±0.50)和(0.45±0.30)mmol/L](P值均<0.05),表明ppp2r1a敲除会扰乱葡萄糖和胆固醇代谢。此外,纯合子小鼠白细胞计数(WBC)和淋巴细胞计数[(1.88±0.89)×109/L和(0.92±0.37)×109/L]低于野生型小鼠[(3.91±0.80)×109/L和(2.74±0.52)×109/L](P值均<0.05)。纯合子小鼠肝脏中糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的mRNA相对表达水平[(0.46±0.11)和(0.72±0.07)]均低于野生型小鼠[(1.02±0.07)和(1.02±0.06)](P值均<0.05)。结论  全器官ppp2r1a基因对成年小鼠的存活是必不可少的,且ppp2r1a基因可能通过调控肝脏葡萄糖和胆固醇代谢发挥重要作用。
关键词 :小鼠;表型;蛋白磷酸酶2A;诱导性基因敲除;糖脂代谢紊乱
Phenotype and mechanism of inducible ppp2r1a knockout mouse model
FanJunling,WangFangping,WangShan,LiuXiaoling,WuXiaonen,ChenWen,ChenLiping,LiWenxue     
Faculty of Preventive Medicine, School of Public Health, Sun Yat-sen University, Guangzhou Key Laboratory of Environmental Pollution and Health Risk Assessment, Guangzhou 510080, China
Corresponding author: Li Wenxue, Email: liwenxue_2000@163.com
Abstract:Objective  Investigate the effects of inducible ppp2r1a knockout on main physiological function in adult mice and study the mechanism.Methods  Ppp2r1aflox/flox mice and CAGG-CreER mice were hybridized to obtain 20 CAGG-CreER ppp2r1aflox/flox and 20 mice in homozygous group. Two groups of mice were divided into 4 groups respectively, finally we got 8 groups with 5 mice in each group. Tamoxifen was injected intraperitoneally to acquire inducible ppp2r1a knockout mice. The knockout efficiency of PP2A Aα in vital organs was measured by Western blot. At 0, 2, 4 and 6 days after injection, we measured body weight, histopathological change, peripheral blood cell counts and blood biochemical. Real-time PCR was performed to measure expression of liver glucolipid metabolism genes.Results  After tamoxifen injection for 6 days, the knockout efficiency of PP2A Aα in vital organs was 35%, 12%, 15%, 60%, 69% and 72%, respectively in heart, liver, spleen, lung, kidney and brain. After tamoxifen injection for 6 days, the weight of homozygous mice was lower than that of wild type mice, with values of (17.42±1.76) g and (21.69±1.82) g, respectively (P<0.05). Moreover, the activity level, abdominal and renal fat were significantly decreased in homozygous mice. Homozygous mice survived no more than 7 days. Compared with wild type mice, the organ coefficient of spleen of homozygous mice was decreased at the 6th day, with values of (0.59±0.10)% and (0.36±0.05)% respectively (P<0.05). Obvious spleen atrophy and marked decrease of nucleated cells were showed by performing HE staining. Tunel staining revealed increased apoptosis ratio of splenic lymphocytes in homozygous mice. The levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate transaminase (AST) of homozygous mice were higher than wild type mice (P<0.05). The values of ALT and AST in homozygous mice were (153.68±62.80) U/L and (193.2±44.28) U/L. The corresponding values in wild type mice were (41.02±12.91) U/L and (69.40±9.55) U/L. The above results indicated that ppp2r1a knockout caused liver damage. Blood sugar level of homozygous mice was lower than in wild type mice (P<0.05), with values of (4.20±1.99) mmol/L and (8.88±0.65) mmol/L respectively. Plasma total cholesterol (TC), high density lipoprotein (HDL) and β-hydroxybutyric acid (β-HB) level of homozygous mice were higher than those of wild type mice (P<0.05). The values of TC, HDL and β-HB in homozygous mice were (3.12±0.39), (1.53±0.38) and (2.49±0.89) mmol/L. The corresponding values in wild type mice were (1.69±0.92), (0.78±0.50) and (0.45±0.30) mmol/L respectively. The above results indicated that ppp2r1a loss interfered glucose and cholesterol metabolism. In addition, we also found that the white blood cell count (WBC) and lymphocyte count (LYM) of homozygous mice were lower than in wild type mice (P<0.05). The values of WBC and LYM in homozygous mice were (1.88±0.89)×109/L and (0.92±0.37)×109/L respectively. The corresponding values in wild type mice were (3.91±0.80)×109/L and (2.74±0.52)×109/L respectively. The mRNA levels of glucose-6-phosphatase (G6P) and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) of homozygous were lower than wild type mice (P<0.05). The fold change of G6P and PEPCK in homozygous mice was 0.46±0.11 and 0.72±0.07 respectively. The corresponding fold change in wild type mice was 1.02±0.07 and 1.02±0.06 respectively.Conclusion  Whole body ppp2r1a is essential for the survival of adult mice, due to the important role in maintaining the metabolism of glucose and cholesterol of liver.
Key words :Mice;Phenotype;Protein phosphatase 2A;Inducible gene knockout;Glucose and lipid metabolism disorder
全文

蛋白质的磷酸化失衡在很多人类疾病的发生发展中起着重要作用,而蛋白磷酸化由蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同调控的。其中,蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)是真核生物中重要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,也是真核生物中含量最丰富的蛋白磷酸酶[1]。PP2A与细胞蛋白质相互作用,进而调控细胞信号转导[2]、细胞转化[3]、细胞周期[4]和细胞凋亡等事件[5]。PP2A以二聚体和三聚体两种形式存在,其中由结构亚基A (scaffolding subunit A, PP2A-A)、催化亚基C(catalytic subunit C, PP2Ac)组成的二聚体称为核心酶,再与调节亚基B (regulatory subunit B)构成PP2A异三聚体称为全酶[6]。A亚基是由15个富含亮氨酸的串联重复序列组成,自发折叠成马蹄样结构连接B、C亚基的支架作用[7],PP2A Aα和PP2A Aβ两种结构异构体分别由ppp2r1a和ppp2r1β两种基因编码,同源性为86%,然而Aα的生物学功能不能被Aβ代替[8]
        PP2A在胚胎发育中有重要作用,特别是对个体发育和存活至关重要[9,10]。以往研究发现,敲除小鼠PP2A-Cα导致小鼠在胚胎期死亡[11],特异性卵母细胞Aα缺失雌鼠生育能力低下并产生死胎和胚胎缺陷[12]。特异性敲除调节T细胞ppp2r1a基因的小鼠,在出生后10~14周出现了外周淋巴组织增生,肺脏、皮肤炎症细胞浸润以及多器官的自身免疫性疾病[13]。在肝特异性敲除PP2A-Cα和PP2A-B56γ的小鼠模型中,动物表现出对胰岛素敏感性增加[14,15],外周血糖降低,肝脏糖原沉积,血清甘油三酯和总胆固醇升高等,提示PP2A在调控机体糖脂代谢中的作用。然而,既往研究关注某一组织的PP2A缺失对个体健康结局的影响,由于全身性PP2A失活会导致胚胎死亡,目前PP2A对成年动物的功能影响尚不清楚。本研究利用CAGG-CreER小鼠与ppp2r1aflox/flox小鼠进行交配获得基因型为CAGG-CreER ppp2r1a flox/flox的纯合子小鼠,并注射他莫昔芬建立了诱导性全身ppp2r1a基因敲除小鼠模型[16,17]。通过对体重、生存状况、各脏器病理改变、外周血细胞计数、生化指标、血糖和脂类代谢等指标的分析,探索PP2A对成年动物整体功能的主要影响和机制,为深入研究PP2A的功能提供了重要的理论依据。

材料与方法  

1.实验动物的繁殖和饲养:  Ppp2r1a flox/flox小鼠和CAGG-CreER小鼠购自美国Jackson实验室,饲养在SPF级动物房(温度为20 ℃,相对湿度为65%~75%,12 h/12 h明暗交替),自由摄食和饮水。将成年雄性ppp2r1a flox/flox小鼠与雌性CAGG-CreER小鼠交配获得CAGG-CreER ppp2r1a flox/-杂合子小鼠,进一步用雄性杂合子与ppp2r1a flox/flox雌鼠交配得到三种基因型小鼠,分别为CAGG-CreER ppp2r1aflox/flox纯合子、CAGG-CreER ppp2r1aflox/-杂合子、ppp2r1a flox/flox野生型小鼠,相同的交配策略几代后得到基因背景相近的足够数量的实验用小鼠,本实验选择CAGG-CreER ppp2r1aflox/flox纯合子和ppp2r1aflox/flox野生型小鼠作为对象。

2.试剂和仪器:  (1)仪器:生物显微镜(德国Leica公司)、便携式血糖测定仪(罗氏公司)、全自动血细胞分析仪(美国Coulter公司)、电泳仪、电泳槽和转膜仪(美国Life公司)、PCR仪(美国Bio-Rad公司)、半自动生化分析仪(西班牙Biosystems公司的BTS-330型号)、实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、酶标仪(美国Bio Tek公司)。(2)试剂:枸橼酸他莫昔芬(美国Selleck Chemicals公司)、戊巴比妥钠和葡萄糖(美国Sigma公司)、Anti-PP2A Aα一抗(美国Cell Signaling Technology公司)、Anti-actin一抗(美国Proteintech公司)、SPF级小鼠饲料(广东省动物中心)、鼠尾鉴定PCR试剂盒(美国Biotool公司)、ELISA试剂盒(美国Millipore公司)、β-羟丁酸(D3-H)试剂盒和游离脂肪酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)、逆转录试剂盒(日本Takara公司)。

3.基因型鉴定:  小鼠出生3周后,剪取鼠尾组织提取DNA,采用鼠尾试剂盒PCR方法来鉴别基因型。目的片段的扩增序列和凝胶成像的产物大小如表1

表1小鼠基因型测定引物序列

4.建立全身ppp2r1a基因诱导敲除模型及分组:  (1)基因诱导敲除模型的建立与分组:将同批出生的20只8周龄CAGG-CreER ppp2r1a flox/flox纯合子小鼠作为纯合子组,将20只ppp2r1a flox/flox野生型小鼠作为野生型组。采用单纯随机法,将纯合子和野生型各分为4组,共8组,每组5只,以100 μl/10 g体重的剂量腹腔注射12.5 mg/ml的枸橼酸他莫昔芬分别注射0、2、4、6 d,其中0 d为未处理组。(2)单纯低血糖小鼠的设立:为了进一步探讨机制,将同窝出生的野生型小鼠5只,设立为单纯低血糖组,禁食前用血糖仪测尾静脉血血糖水平,禁食48 h后测定血糖值低于4.5 mmol/L,即认为是单纯由禁食诱导的低血糖小鼠。

5.系统性指标检测:  用质量分数为1%戊巴比妥钠(100 μl/10 g体重)麻醉后解剖小鼠,下腔静脉采集血液置2 ml EDTA抗凝管,完整分离主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑),称重记录并计算脏器系数(脏器湿重/小鼠体重)。全自动血细胞计数仪检测血常规,常温下500×g,离心10 min,收集血浆,用自动血生化分析仪检测小鼠血浆中反映肝肾功能和代谢生化指标,如谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、尿酸、葡萄糖、总胆固醇、HDL-C等,用血糖仪监测尾静脉血糖,并用试剂盒方法检测血浆游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)含量和β-羟丁酸浓度。根据Trinder反应原理用试剂盒方法检测肝脏组织中的葡萄糖浓度。

6.Western blot检测小鼠主要脏器的敲除效率:  取小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑约60 mg,加入RIPA强裂解液,匀浆后冰上裂解,每10分钟漩涡震荡一次,共3次,4 ℃,14 000×g离心30 min后取上清即是总蛋白。质量分数为10%的单一胶分离蛋白,湿转到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)上,质量分数为5%脱脂奶粉封闭1 h,然后加入抗Aα(1:1 000)抗体在4 ℃孵育过夜。次日用PBST液洗3次,每次5 min,加入二抗后室温孵育1 h。加上ECL发光液,用化学发光仪曝光并使用Quantity One软件对目的条带进行光密度值测定。敲除效率=(1-纯合子Aα基因相对表达量/野生型Aα基因相对表达量)×100%。

7.组织学检查和Tunel染色:  多聚甲醛固定的组织石蜡包埋、切片、脱蜡水化后,苏木素-伊红染色15 min,质量分数为1%盐酸酒精分化1 s后氨水返蓝2 s,梯度乙醇脱水,封片,光镜下观察各组织病理改变并拍照保存。参照罗氏Tunel染色试剂盒方法依次进行Tunel染色:石蜡切片脱蜡至水、修复、破膜、加试剂盒中的试剂1和2、阻断内源性过氧化物酶、加试剂3(converter-POD)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色、复染细胞核和脱水封片。

8.Real-time PCR法测定:  采用Trizol方法抽提RNA,用Takara逆转录试剂盒进行单链cDNA的合成(20 μl体系;37 ℃,15 min;95 ℃,5 s),在Real-time PCR仪器V7系统上(条件95 ℃,2 min;95 ℃,30 s;65 ℃,1 min;40个循环)进行扩增,检测葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)、葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate,G6P)、PEPCK、脂肪合成基因脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸β氧化基因肉碱脂酰转移酶Ⅰ(carnitine palmitoyltransferase 1a,CPT-1a)、酮体合成基因HMGCoA合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase2,HMGCS2)和β-羟丁酸脱氢酶(β-hydroxybutyrate dehydrogenase,β-HBDH)的表达水平,用2-ΔΔCt值进行分析。

9.统计学分析:  采用SPSS 20.0软件进行分析。小鼠体重、脏器系数、血生化和血常规等数据分布属于正态分布,以±s表示,采用t检验对野生型和纯合子型小鼠的敲除效率血常规、血生化进行比较;采用单因素方差分析比较两组小鼠不同时间点敲除效率、脏器系数、血细胞计数、血糖和肝脏葡萄糖的差异和三组之间的糖脂代谢基因表达的差异,组间两两比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.他莫昔芬诱导性全身ppp2r1a基因敲除小鼠模型的构建:  小鼠基因型鉴定如图1所示,2条等位基因均含有loxp位点(825 bp)并且带有Cre重组酶序列(100 bp)的即为他莫昔芬诱导性全身ppp2r1a基因敲除纯合子小鼠(CAGG-CreER ppp2r1aflox/flox),仅2条等位基因有loxp位点却没有Cre重组酶序列的为野生型小鼠(ppp2r1aflox/flox),1条等位基因含有loxp位点并且带Cre重组酶序列的为杂合子小鼠(CAGG-CreER ppp2r1aflox/-)。他莫昔芬诱导敲除6 d后,Western blot结果显示心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑的PP2A Aα敲除效率分别约为35%、12%、15%、60%、69%和72% (表2)。且在不同时间点,肝脏、脾脏和脑组织敲除效率不同。与同时间点野生型相比,他莫昔芬诱导敲除4 d后,纯合子小鼠肝脏和脾脏组织的PP2A Aα蛋白水平最低,肝脏敲除效率为35%,脾脏为65%;他莫昔芬诱导敲除6 d后,肝脏和脾脏敲除效率降低。脑组织在诱导4 d后敲除效率约为35%,6 d后敲除效率升高(表3)。纯合子小鼠在他莫昔芬的诱导下心、肺、肾和脑的基因敲除效率在6 d后最高,且脑组织存在良好的时间效应关系。

表2他莫昔芬诱导敲除6 d后不同类型小鼠各脏器Aα基因的相对表达量(±sn=3)
表3他莫昔芬分别诱导0、2、4和6 d后不同类型小鼠肝、脾和脑组织的Aα基因的相对表达量(±sn=2)
图1全身和肝特异性ppp2r1a基因敲除小鼠基因型鉴定

2.ppp2r1a基因全身敲除对小鼠生存状况的影响:  他莫昔芬注射诱导敲除后,纯合子小鼠体重[5 d和6 d后分别为(18.57±2.08)、(17.42±1.76)g]低于野生型小鼠[5 d和6 d后分别为(21.39±1.76)、(21.69±1.82)g](P值均<0.05)。纯合子小鼠活动度减少并陆续死亡,第6天解剖小鼠,肉眼可见纯合子小鼠腹部和肾周脂肪减少,肝脏轻微缩小,脾脏严重萎缩,纯合子小鼠脾脏的脏器系数低于野生型小鼠(P<0.05)(表4)。组织病理HE染色观察到纯合子小鼠的脾脏皮质、髓质萎缩明显,小梁消失,脾小结数量增加但体积缩小,有核细胞明显减少。此外,脾脏的Tunel阳性明显多于野生型(图2),表明PP2A Aα对小鼠脾脏结构和功能的维持至关重要。

表4他莫昔芬诱导性全身ppp2r1a基因敲除后4个时间点小鼠脏器系数(%,±sn=5)
图2ppp2r1a敲除小鼠脾脏结构和脾细胞凋亡的影响

3.诱导性全身ppp2r1a基因敲除对小鼠血细胞的影响:  他莫昔芬连续注射6 d后,纯合子小鼠外周血红细胞计数(red blood count,RBC)高于野生型小鼠(P<0.05),而WBC、LYM和淋巴细胞百分比(lymphocyte ratio,LY)却低于野生型组(P<0.05)(表5);并且纯合子小鼠外周血WBC、LYM和LY随敲除时间呈现逐渐降低(表6),表明诱导性全身ppp2r1a基因敲除影响小鼠外周血细胞计数和构成。

表5他莫昔芬诱导全身性ppp2r1a基因敲除6 d后两组小鼠的血常规情况(±sn=5)
表6全身性ppp2r1a基因敲除小鼠外周血白细胞和淋巴细胞的时间效应(±sn=5)

4.PP2A Aα缺失对糖脂代谢的影响:  他莫昔芬连续注射6 d后,纯合子小鼠血浆中ALT、AST和尿酸水平均升高,并且葡萄糖降低(P<0.05)(表7),纯合子小鼠血浆中总胆固醇、HDL-C和β-HB水平均高于野生型小鼠(表7),其他生化指标(FFA、CR、UREA、甘油三酯和LDL-C)差异没有统计学意义。他莫昔芬连续注射6 d的血糖监测和肝脏葡萄糖检测表明,6 d后纯合子小鼠血糖低于野生型小鼠(P<0.05),且注射期间纯合子小鼠肝脏葡萄糖水平逐渐下降(表8)。以上结果表明,PP2A Aα会缺失引起肝功能损伤及糖脂代谢紊乱。

表7他莫昔芬诱导敲除6 d对小鼠外周血生化的影响(±sn=5)
表8基因诱导敲除小鼠外周血糖和肝脏葡萄糖水平(±sn=5)

5.PP2A Aα缺失导致糖脂代谢紊乱的机制:  严重的低血糖和糖脂代谢紊乱可能是小鼠死亡的直接原因,为了进一步探讨PP2A Aα缺失引起糖脂代谢紊乱的机制,通过检测肝脏糖异生和酮体生成相关基因的表达,结果发现单纯低血糖组的生糖基因G6P和PEPCK表达增加,高于野生型组,而纯合子小鼠的G6P和PEPCK却低于低血糖组,且也低于野生型组;HMGCS2和β-HBDH在基因敲除组中均低于野生型组(表9)。表明在低血糖情况下,糖异生途径却由于Aα缺失受到明显的抑制,从而影响血糖的生成,Aα的缺失抑制了低血糖诱导肝脏酮体生成相关基因的高表达,进一步加剧能量供应不足;低血糖组小鼠Aα和Cα表达水平高于野生型组,提示PP2A参与低血糖的代偿性调节。

表9全身性ppp2r1a基因敲除小鼠肝脏糖脂代谢基因表达(±sn=5)

讨论  PP2A调控蛋白质的去磷酸化,与真核细胞的生命活动密切相关。既往研究仅揭示PP2A在某一组织或某一时间段对个体健康结局的影响,由于整体PP2A失活导致胚胎致死,限制了PP2A对成年动物整体功能影响的研究。本研究构建成年小鼠的诱导性全身ppp2r1a基因敲除模型,证实ppp2r1a基因对成年小鼠的存活是必不可少的,并可能通过调控肝脏葡萄糖和胆固醇代谢在维持血糖水平过程中发挥重要作用。本研究为PP2A整体功能和组织特异性的功能研究提供了新的方法和思路。
        他莫昔芬诱导性基因敲除系统是一种依赖雌激素受体的基因敲除系统。不同脏器中雌激素受体的表达丰度、血流量和敏感程度等存在差异,因此各脏器呈现出不同程度的基因敲除。有研究报道,在成年动物中单次注射他莫昔芬24 h后,大多数器官表达Cre重组酶,连续注射5 d后重组效率提高[17]。连续6 d注射他莫昔芬并观察不同时间点的表型改变时,其肝脏和脾脏Aα蛋白水平在诱导敲除4 d后相对最低,6 d后略升高,可能原因是在Aα缺失导致细胞逐渐凋亡或坏死,而没有发生基因敲除的细胞比例相对升高。
        研究发现,成年动物诱导全身Aα敲除6 d开始小鼠陆续死亡,可能与Aα缺失后引起外周血糖降低有关。葡萄糖是细胞的主要能量物质,在糖供应不足或饥饿的情况下,正常机体会通过分解脂肪、加快糖异生来调节血糖平衡和维持机体能量供应。而在本动物模型中,低血糖对糖异生和脂肪酸氧化供能相关基因的诱导能力降低,这可能是导致持续性低血糖的最直接原因。研究表明PP2A可通过PP2A-AMPK-FoxO1通路影响饥饿条件下肝脏糖异生基因G6P和PEPCK的表达[18],PP2A还可通过调节AKT的活性来影响糖异生转录因子FoxO1的表达,从而调节胰岛素激活下的外周血糖水平[19]。提示PP2A在调控小鼠的糖脂代谢中起着关键作用,并且在诱导性全身敲除小鼠模型中,糖脂代谢紊乱是最敏感的表型之一。
        在饥饿和糖供应不足的情况下酮体是包括脑在内的许多组织的能量来源,在禁食情况下,机体通过胰高血糖素上调酮体生成基因ACAT1、HMGCS2和β-HBDH的表达从而激活酮体合成作用[20],HMGCS2是原癌基因c-myc的直接靶点[21],c-myc可抑制其转录活性,而PP2A又是介导c-myc降解的关键蛋白[22],因此,推测PP2A可能通过c-myc通路来调控Aα缺失小鼠的生酮基因表达,但仍需要进一步研究阐明。
        本研究借助它莫昔芬诱导性全身ppp2r1a基因敲除动物模型进一步阐述了Aα在成年动物存活中的作用以及对主要脏器功能的影响,揭示Aα在调控肝脏糖脂代谢和脾脏细胞凋亡中的重要作用,为PP2A整体功能研究和组织特异性的功能研究提供模型基础和理论依据。

参考文献
[1]JanssensV, GorisJ. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling[J]. Biochem J, 2001,353(Pt 3):417-439. DOI: 10.1042/0264-6021:3530417.
[2]SontagE. Protein phosphatase 2A: the Trojan Horse of cellular signaling[J]. Cell Signal, 2001,13(1):7-16. DOI: 10.1016/S0898-6568(00)00123-6.
[3]ChenW, PossematoR, CampbellKT, et al. Identification of specific PP2A complexes involved in human cell transformation[J]. Cancer Cell, 2004,5(2):127-136. DOI: 10.1016/S1535-6108(04)00026-1.
[4]AltiokS, XuM, SpiegelmanBM. PPAR gamma induces cell cycle withdrawal: inhibition of E2F/DP DNA-binding activity via down-regulation of PP2A[J]. Genes Dev, 1997,11(15):1987-1998. DOI: 10.1101/gad.11.15.1987.
[5]NeuzilJ, WeberT, Schr?derA, et al. Induction of cancer cell apoptosis by alpha-tocopheryl succinate: molecular pathways and structural requirements[J]. FASEB J, 2001,15(2):403-415. DOI: 10.1096/fj.00-0251com.
[6]KielyM, KielyPA. PP2A: The Wolf in Sheep's Clothing?[J]. Cancers (Basel), 2015,7(2):648-669. DOI: 10.3390/cancers7020648.
[7]ChoUS, XuW. Crystal structure of a protein phosphatase 2A heterotrimeric holoenzyme[J]. Nature, 2007,445(7123):53-57. DOI: 10.1038/nature05351.
[8]MumbyM. PP2A: unveiling a reluctant tumor suppressor[J]. Cell, 2007,130(1):21-24. DOI: 10.1016/j.cell.2007.06.034.
[9]YangJ, WuJ, TanC, et al. PP2A:B56epsilon is required for Wnt/beta-catenin signaling during embryonic development[J]. Development, 2003,130(23):5569-5578. DOI: 10.1242/dev.00762.
[10]G?tzJ, ProbstA, MistlC, et al. Distinct role of protein phosphatase 2A subunit Calpha in the regulation of E-cadherin and beta-catenin during development[J]. Mech Dev, 2000, 93(1/2): 83-93. DOI: 10.1016/S0925-4773(00)00267-7.
[11]G?tzJ, ProbstA, EhlerE, et al. Delayed embryonic lethality in mice lacking protein phosphatase 2A catalytic subunit Calpha[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998,95(21):12370-12375. DOI: 10.1073/pnas.95.21.12370.
[12]HuMW, WangZB, JiangZZ, et al. Scaffold subunit Aalpha of PP2A is essential for female meiosis and fertility in mice[J]. Biol Reprod, 2014,91(1):19. DOI: 10.1095/biolreprod.114.120220.
[13]ApostolidisSA, Rodríguez-RodríguezN, Suárez-FueyoA, et al. Phosphatase PP2A is requisite for the function of regulatory T cells[J]. Nat Immunol, 2016,17(5):556-564. DOI: 10.1038/ni.3390.
[14]XianL, HouS, HuangZ, et al. Liver-specific deletion of Ppp2cα enhances glucose metabolism and insulin sensitivity[J].Aging (Albany NY),2015,7(4):223-232. DOI: 10.18632/aging.100725.
[15]ChengYS, SeibertO, Kl?tingN, et al. PPP2R5C Couples Hepatic Glucose and Lipid Homeostasis[J]. PLoS Genet, 2015,11(10):e1005561. DOI: 10.1371/journal.pgen.1005561.
[16]SohalDS, NghiemM, CrackowerMA, et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein[J]. Circ Res, 2001,89(1):20-25. DOI: 10.1161/hh1301.092687.
[17]HayashiS, McMahonAP. Efficient recombination in diverse tissues by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse[J]. Dev Biol, 2002,244(2):305-318. DOI: 10.1006/dbio.2002.0597.
[18]YadavH, DevalarajaS, ChungST, et al. TGF-β1/Smad3 Pathway Targets PP2A-AMPK-FoxO1 Signaling to Regulate Hepatic Gluconeogenesis[J].J Biol Chem,2017,292(8):3420-3432. DOI: 10.1074/jbc.M116.764910.
[19]GalboT, PerryRJ, NishimuraE, et al. PP2A inhibition results in hepatic insulin resistance despite Akt2 activation[J]. Aging (Albany NY), 2013,5(10):770-781. DOI: 10.18632/aging.100611.
[20]HegardtFG. Mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase: a control enzyme in ketogenesis[J]. Biochem J, 1999,338 (Pt 3):569-582.
[21]CamareroN, MascaróC, MayordomoC, et al. Ketogenic HMGCS2 is a c-Myc target gene expressed in differentiated cells of human colonic epithelium and down-regulated in colon cancer[J]. Molecular Cancer Research Mcr, 2006, 4(9): 645. DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-05-0267.
[22]SeshacharyuluP, PandeyP, DattaK, et al. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer[J]. Cancer Lett, 2013, 335(1): 9.DOI:10.1016/j.canlet.2013.02.036.