中华预防医学杂志    2018年05期 小鼠脑微血管周细胞永生化模型的建立及其在脑血管毒物筛查中的初步应用    PDF     文章点击量:576    
中华预防医学杂志2018年05期
中华医学会主办。
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赵和平 高艳芳 夏冬 赵志强 吴赛 王晓会 柳怀湘 肖琛 邢秀梅 何云
ZhaoHeping,GaoYanfang,XiaDong,ZhaoZhiqiang,WuSai,WangXiaohui,LiuHuaixiang,XiaoChen,XingXiumei,HeYun
小鼠脑微血管周细胞永生化模型的建立及其在脑血管毒物筛查中的初步应用
The establishment of the immortalized mouse brain microvascular pericytes model and its preliminary application in screening of cerebrovascular toxicants
中华预防医学杂志, 2018,52(5)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.05.014

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投稿日期: 2018-01-15
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小鼠脑微血管周细胞永生化模型的建立及其在脑血管毒物筛查中的初步应用
赵和平 高艳芳 夏冬 赵志强 吴赛 王晓会 柳怀湘 肖琛 邢秀梅 何云     
赵和平 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
高艳芳 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
夏冬 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
赵志强 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
吴赛 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
王晓会 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
柳怀湘 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
肖琛 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
邢秀梅 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
何云 510080 广州, 中山大学公共卫生学院预防医学系
摘要: 目的  建立小鼠脑微血管周细胞永生化模型并应用于脑血管毒物筛查研究。方法  取3周龄雄性C57BL/6小鼠2只,取小鼠大脑皮质,用组织分离和酶消化法培养原代小鼠脑微血管周细胞,逆转录病毒转染LT质粒构建永生化细胞株。采用单克隆法纯化细胞,采用细胞免疫荧光鉴定细胞纯度,MTS法绘制细胞生长曲线,将永生化小鼠脑微血管周细胞分别暴露于0、160、320、640、1 280、2 560 μmol/L的醋酸铅和0、5、10、20、40、80 μmol/L的氯化镉及0、5、10、20、40、80 μmol/L的亚砷酸钠24 h后,用MTS法检测细胞活力,用线性回归法计算不同毒物半数致死量(LD50)。结果  永生化脑微血管周细胞呈长梭形生长,表达周细胞特异性标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),且都表达功能性收缩蛋白中间丝蛋白-波形蛋白(Vimentin);原代脑微血管周细胞增殖缓慢,接种第3天进入对数生长期,倍增时间为48 h;永生化脑微血管周细胞增殖旺盛,接种第3天进入对数生长期,倍增时间为24 h;永生化脑微血管周细胞生存率随各毒物染毒剂量的增加呈现下降趋势,醋酸铅LD50为2 025.0 μmol/L,氯化镉LD50为36.6 μmol/L,亚砷酸钠LD50为33.2 μmol/L。结论  利用逆转录病毒转染LT质粒可成功构建永生化小鼠脑微血管周细胞,并可应用于脑血管毒物筛查研究,对永生化小鼠脑微血管周细胞的毒性大小依次为亚砷酸钠、氯化镉、醋酸铅。
关键词 :周细胞;醋酸铅;氯化镉;亚砷酸钠;细胞毒性
The establishment of the immortalized mouse brain microvascular pericytes model and its preliminary application in screening of cerebrovascular toxicants
ZhaoHeping,GaoYanfang,XiaDong,ZhaoZhiqiang,WuSai,WangXiaohui,LiuHuaixiang,XiaoChen,XingXiumei,HeYun     
Sun Yat-sen University School of Public Health, Guangzhou 510080, China
Corresponding author: He Yun, Email: heyun7@mail.sysu.edu.cn
Abstract:Objective  To establish the immortalized mouse brain microvascular pericytes model and to apply to the cerebrovascular toxicants screening study.Methods  Brain pericytes were isolated from 3 weeks of mice by tissue digestion. Immortalized pericyte cell line was constructed by infecting with LT retrovirus. Monoclone was selected to purify the immortalized pericyte cell line. The pericyte characteristics and purity were explored by immunocytochemistry. Cell proliferation was measured by using the Pomega MTS cell Proliferation Colorimetric Assay Kit. Pericytes were treated with 0, 160, 320, 640, 1 280, 2 560 μmol/L lead acetate, 0, 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L cadmium chloride and 0, 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L sodium arsenite in 24 hours. Cell toxicity of each group was determined by MTS assay, median lethal dose (LD50) was calculated in linear regression.Results  Mouse brain pericytes were successfully isolated by tissue separation and enzyme digestion method. After immortalized by LT retroviruses, monoclone was selected and expanded to establish pericyte cell line. The brain pericytes exhibited typical long spindle morphology and positive staining for α-SMA and Vimentin. The proliferation of brain pericytes cell lines was very slowly, and the doubling time was about 48 hours. The proliferation of immortalized brain pericytes cell lines was very quickly, and the doubling time was about 24 hours. After lead acetate, cadmium chloride and sodium arsenite treatment for 24 hours respectively, gradual declines in cell viability were observed. The LD50 of lead acetate was 2 025.0 μmol/L, the LD50 of cadmium chloride was 36.6 μmol/L, and the LD50 of sodium arsenite was 33.2 μmol/L.Conclusion  The immortalized mouse brain microvascular pericyte model is established successfully by infecting with LT retrovirus, and can be applied to screen cerebrovascular toxicants. The toxicity of these toxicants to immortalized mouse brain microvascular pericyte is in sequence: sodium arsenite,cadmium chloride, lead acetate.
Key words :Pericytes;Lead acetate;Cadmium chloride;Sodium arsenite;Cell toxicity
全文

周细胞广泛分布于全身的毛细血管和微血管的管壁,其在毛细血管壁上的覆盖率达到了22%~32%,脑中周细胞与内皮细胞的比例较高,达到1∶3[1]。周细胞和内皮细胞一起构成了微血管和组织间屏障,是维持内环境稳定的重要因素。周细胞是血-脑屏障基本结构之一,它和内皮细胞通过缝隙连接、紧密连接、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)等相联系,这种联系对维持血-脑屏障功能的稳定十分重要[2,3,4]。目前对于血脑屏障的研究大多局限于脑微血管内皮细胞及内皮细胞间的紧密连接等问题,对于周细胞的研究相对较少。
        周细胞表达大量的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和神经胶质细胞2型硫酸软骨素糖蛋白(neuroglial cell 2 chondroitin sulfate proteoglycan,NG-2) [5,6,7],同时来源于脑部位的微血管周细胞还强烈表达一种中间丝蛋白-波形蛋白(Vimentin)[8],因此本文选择α-SMA、NG-2和Vimentin蛋白作为脑微血管周细胞的细胞特异性和位置特异性标记分子。
        我国脑血管病近年在全部死亡病因顺位中呈现明显前移的趋势,城市和农村脑血管病死亡已分别上升至第1、2位[9],降低脑血管病发病率和病死率的根本措施在于预防。我国环境污染严重,环境污染物是诱发脑血管疾病的重要因素之一,筛查脑血管毒物对于脑血管病的预防具有重要意义。筛查脑血管毒物需要大量的细胞,而体外培养的原代周细胞生长增殖能力有限,多传至10代左右就呈现出衰老状态,不再增殖,不适用于大规模的毒物筛查。细胞永生化也称不死性,是细胞获得持续生长增殖能力的特性,可至少传至40~50代。本研究通过逆转录病毒转染LT质粒对小鼠脑原代周细胞进行永生化,使其具有较好的传代能力。
        本研究通过小鼠脑微血管周细胞的分离、培养、永生化、鉴定等方法,建立小鼠脑微血管周细胞永生化模型,为研究周细胞在血脑屏障中的作用及脑血管毒物筛查提供了有力的工具。

材料与方法  

1.实验动物及处理:  本研究方案经中山大学公共卫生学院动物伦理委员会审查批准,实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2011-0112。10周龄性成熟C57BL/6雌鼠、雄鼠均购于中山大学实验动物中心,雌雄鼠按照2∶1比例合笼,SPF级培养。待雌鼠怀孕、生仔后,取3周龄小鼠待分离原代小鼠脑微血管周细胞用。

2.主要试剂和仪器:  DMEM/F12杜氏改良伊格尔培养基购自Corning公司;质量分数0.25%胰酶和100单位/ml氨苄青霉素、100 μg/ml硫酸链霉素购自美国Gibco公司;α-SMA、Vimentin抗体、荧光标记的Phalloidin染料(完整的F-actin微丝蛋白荧光染料)购自Proteintech公司;荧光二抗购自Life公司;MTS比色试剂盒购自美国Promega公司;CO2细胞培养箱,购自美国Binder公司;倒置荧光显微镜,购自德国LEICA公司;ELX800酶标仪,购自美国BIO-TEK公司。

3.小鼠脑微血管周细胞的分离和原代培养:  体积分数为75%酒精预消毒工作区域30 s。取3周龄雄性小鼠2只,1.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉,放入第1个未加PBS的10 cm培养皿中,小鼠头部酒精消毒5 min。用第1套手术器械剪开小鼠头颅部位皮肤,用第2套手术器械打开小鼠颅骨,取出脑组织,将脑组织转移至第2个加有4 ℃预冷的PBS的10 cm培养皿中。用第3套手术器械在大体显微镜下小心撕去脑膜,去除脑髓质部分,将脑皮质转移至第3个10 cm培养皿中,后进入细胞房生物安全柜操作。用第4套手术器械剪碎小鼠脑皮质至糜状(约剪2 min),将糜状皮质组织转移至15 ml离心管中,后参照秦伟伟等[10]的实验方法分离、培养原代脑微血管周细胞。

4.原代脑微血管周细胞的鉴定、形态观察及功能蛋白表达鉴定:  参照蒋骏等[11]细胞免疫荧光方法进行细胞免疫荧光鉴定,4 ℃孵育抗α-SMA一抗、抗Vimentin一抗、荧光标记的Phalloidin染料过夜,PBS洗3次,每次3 min;加入相应的荧光二抗,室温孵育1h,PBS洗3次,每次3 min;室温孵育4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 15 min,PBS洗3次,每次3 min,倒置荧光显微镜观察荧光强度。

5.逆转录病毒转染LT质粒构建永生化细胞模型:  第1天接种293T细胞,以2.5×105接种293T细胞至6 cm细胞培养皿中,待细胞长至50%融合度时,准备做转染。第2天转染LT质粒,按照下列配方配制转染体系,准备转染。先在0.6 ml EP管中加入129.9 μl ddH2O,然后加入3 μg质粒,逆转录病毒包装载体质粒(pCL-Ampho):LT=1∶1,再迅速在管底部加入2 mol/L的CaCl2 18.6 μl,最后沿着管壁轻轻加入2×HBS 150 μl,体系总体积约300 μl。用量程为1 ml的移液枪吹气泡混匀5 min,室温静置25 min。吸一些细胞培养基至混合体系中,轻轻混匀后逐滴加入293T细胞中,293T细胞培养基总体积为3 ml。第3天换液并准备周细胞。在6孔板中接种2.0×105个脑微血管周细胞,24 h后细胞融合度70%~80%左右。第4天收集病毒上清液感染周细胞。收集293T细胞培养基,用0.45 μm孔径滤器过滤至15 ml离心管中,加入等体积新鲜完全培养基,按凝聚胺(polybrene):培养基=1∶2 000的比例加入浓度为10 mg/ml的凝聚胺,轻轻混匀后加入周细胞中,连续培养24 h。第5天终止感染。更换新鲜完全培养基,继续培养24 h。第6天阳性细胞筛选。感染细胞用含终浓度为250 μg/ml G418的培养基筛选阳性细胞,每3天更换含G418新鲜完全培养基,筛选4周。当对照组细胞完全死亡后,筛选组细胞仍有存活,表明筛选成功,更换新鲜培养基扩大阳性细胞。做细胞免疫荧光,观察α-SMA表达情况,进行纯度鉴定。

6.永生化脑微血管周细胞单克隆挑选:  质量/体积分数为0.25%胰酶消化永生化脑微血管周细胞,细胞计数,吸取48个细胞至19.2 ml完全培养基中,混匀,每孔200 μl细胞液接种至96孔板(保证平均细胞数为0.5个/孔);第2天光学显微镜下观察每孔细胞生长情况,标记单个细胞孔;待单细胞长满后消化接种至24孔板,继续培养,长满后继续消化接种至较大皿中做扩大培养。采用细胞免疫荧光α-SMA、NG-2染色进行单克隆细胞鉴定、F-actin染色进行形态观察以及蛋白Vimentin染色进行功能蛋白表达鉴定。

7.MTS比色法测定原代及永生化脑微血管周细胞的增殖特性:  取第3天处于对数生长期的原代及永生化脑微血管周细胞,质量分数为0.25%胰酶消化5 min,用含20%FBS F12/DMEM制成细胞悬液,细胞计数板计数,接种细胞至96孔板中,每孔细胞数量为1.5×104,每孔体积为200 μl。37 ℃细胞培养箱中培养,每3天更换新鲜培养基。第1天接种细胞4 h后每孔加20 μl MTS,37 ℃培养箱孵育1 h后于490 nm处测每孔吸光度,设4个副孔,并设不加细胞的空白对照组。后续每天同样时间、同样操作测每孔吸光度,制成细胞生长曲线。

8.MTS比色法测定铅、镉、砷暴露对永生化脑微血管周细胞的存活率影响:  取对数生长期的永生化脑微血管周细胞,质量/体积分数为0.25%胰酶消化,制成细胞悬液。细胞计数板按每孔1.5×104接种,体积为200 μl的量接种至96孔板。每个剂量设3个复孔,并设空白调零组。醋酸铅设6个剂量组,分别为0、160、320、640、1 280、2 560 μmol/L,氯化镉和亚砷酸钠分别设0、5、10、20、40、80 μmol/L 6个剂量组。染毒24 h后加20 μl MTS 37 ℃培养箱孵育1 h,于490 nm波长测吸光度值(A),计算相对生存率。按照线性回归法计算每种毒物的半数致死量(median lethal dose, LD50)。细胞相对生存率=(A实验组-A空白调零组)/(A对照组-A空白调零组)×100%。

9.统计学分析:  采用Excel 2007进行数据录入,采用SPSS 20.0进行统计分析,图表绘制采用GraphPad Prism 6软件,用线性回归法计算铅、镉、砷暴露对永生化脑微血管周细胞的LD50,用t检验进行差异性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.原代脑微血管周细胞的鉴定、形态观察及功能蛋白表达鉴定:  细胞免疫荧光结果显示,细胞形态呈长梭形或类圆形(图1J图1K图1L),表达周细胞的特异性标记物α-SMA,且与DAPI对应关系良好(图1A图1B图1C)。随机选取5个这样视野进行细胞计数,结果显示,分离得到的原代小鼠脑微血管周细胞纯度达99%以上。Vimentin蛋白染色结果显示,分离得到的脑微血管周细胞强烈表达该蛋白(图1D图1E图1F),提示体外得到的周细胞依然保留其在体内时的重要的收缩血管的细胞特性。

图1小鼠脑微血管周细胞纯度鉴定、形态观察和功能蛋白表达鉴定(×400)

2.永生化脑微血管周细胞纯度鉴定:  细胞免疫荧光结果显示,永生化小鼠脑微血管周细胞纯度达99%以上,个别细胞为杂细胞,不表达α-SMA(图2C箭头处)。

图2小鼠永生化脑微血管周细胞纯度鉴定(×400)

3.永生化脑微血管周细胞单克隆挑选:  细胞免疫荧光结果显示,挑选出的单克隆细胞均表达α-SMA蛋白和NG-2蛋白(见图3C图3I),与DAPI完全吻合,而阴性对照组不表达α-SMA蛋白和NG-2蛋白(图3F图3L),提示挑选出的单克隆细胞为永生化脑微血管周细胞。F-actin染色发现该永生化脑微血管单克隆周细胞形态呈长梭形,与原代细胞相比胞体较小(图3O)。功能蛋白染色发现,该细胞经永生化后仍强烈表达Vimentin蛋白(图3R)。

图3小鼠永生化脑微血管单克隆周细胞纯度鉴定、形态观察、功能蛋白表达鉴定(×400)

4.原代及永生化脑微血管周细胞的生长曲线:  如图4所示,原代脑微血管周细胞接种后培养至第3天进入对数生长期,生长增殖缓慢,倍增时间约为48 h。永生化脑微血管周细胞接种后培养至第3天进入对数生长期,生长增殖迅速,倍增时间约为24 h,培养至第6天进入衰老期。整个细胞增殖期间,永生化脑微血管周细胞的活力高于原代脑微血管周细胞。

图4小鼠原代及永生化脑微血管单克隆周细胞生长曲线

5.铅、镉、砷暴露对永生化脑微血管周细胞的存活率影响:  铅、镉、砷暴露对永生化脑微血管周细胞的影响结果见图5。各种毒物处理细胞24 h后,细胞相对生存率均随着染毒剂量的增加而降低,根据线性回归法计算得到醋酸铅LD50为2 025.0 μmol/L,氯化镉LD50为36.6 μmol/L,亚砷酸钠LD50为33.2 μmol/L。

图5铅、镉、砷暴露对小鼠永生化脑微血管周细胞存活率影响

讨论  周细胞是血-脑屏障的组成部分之一,在体外研究血-脑屏障中,得到具有较强分化能力的周细胞是非常重要的。以往研究者分离得到的周细胞多来源于大鼠的脑微血管周细胞或是小鼠来源的胎盘微血管周细胞,且都为原代细胞[10,11],传代数至10代左右,细胞就基本不再分裂,想长期使用周细胞模型有很大的不便。本文作者分离得到原代小鼠脑微血管周细胞后,对原代周细胞进行了永生化,使其可传至40~50代,为体外研究血脑屏障提供了有力的工具。
        为保证无菌,在分离脑皮质的过程中,除要对工作区域的台面和空气进行消毒外,另外一个很重要的操作就是要多准备几套高压灭菌的手术器械。剪皮肤、开颅骨、去脑膜、取大脑皮质、剪碎皮质等过程分别使用不同的手术器械,减少细胞污染的机会。盛装脑组织的10 cm皿中要预先倒入适量4 ℃预冷的PBS,目的是减少分离过程中组织、细胞的代谢。脑膜要小心剔除干净,因为脑膜部位有丰富的大血管,若不剔除干净,可导致大血管内皮细胞的污染。本研究分离得到的细胞α-SMA免疫荧光染色阳性,生长增殖能力强,且强烈表达Vimentin蛋白,表明该周细胞依然保留在体内收缩血管的功能,可作为一个很好的细胞模型进行后续研究。
        猿猴肾细胞病毒(simian virus,SV40)是一种具有感染和转化细胞能力的DNA病毒,SV40编码的大T抗原(large T antigen,LT)是启动细胞转化所必需的,转化细胞的表型必须要有LT的连续表达[12,13]。笔者通过LT逆转录病毒感染,成功构建永生化细胞株。需要注意的是,收集病毒液感染原代周细胞之后,要给原代周细胞足够的时间表达整合进去的抗性基因,才可进行G418筛选。否则,即使目的基因转染成功,未有足够的时间表达抗性基因,一经药筛,细胞仍会全部死亡,导致整个永生化步骤的失败。后经α-SMA染色发现,永生化之后的细胞并非全部为脑微血管周细胞,还有少量的杂细胞存在,表明原代周细胞纯度不是100%。后经挑选单克隆,成功获得纯度为100%的永生化小鼠脑微血管周细胞。永生化周细胞经Vimentin蛋白染色,发现该周细胞仍可强烈表达Vimentin蛋白,表明原代周细胞经永生化后,仍保留有在体内可收缩血管的特性。
        铅、镉、砷均具有严重的神经毒性。铅通过影响N-甲基-D-天冬氨酸受体与其相应位点的作用,从而影响个体认知功能等[14]。铅与Ca2+竞争进入细胞内,促使细胞膜导电性改变。铅促进神经细胞从内质网中释放Ca2+,使胞内Ca2+浓度增高,铅还可竞争性阻断对电压敏感的钙通道[15]。镉可破坏血-脑屏障,进入中枢神经系统,影响神经递质的含量和相关酶的活性[16]。砷在脑组织中有蓄积作用,早期砷暴露会对儿童神经系统的正常发育产生不良影响[17]。资料显示,铅、镉和砷与对血-脑屏障有协同毒作用,但是血-脑屏障对这几种重金属哪种的毒作用最敏感、对血-脑屏障毒作用的敏感靶细胞是哪种以及具体如何破坏血-脑屏障的分子机制尚不清楚,有待进一步研究[18]。本文选用脑微血管周细胞作为靶细胞,选用醋酸铅、氯化镉、亚砷酸钠作为备选毒物,经24 h急性毒性染毒后计算各毒物LD50。算得醋酸铅LD50约为2 025.0 μmol/L,氯化镉LD50约为36.6 μmol/L,亚砷酸钠LD50约为33.2 μmol/L,三种毒物中,永生化小鼠脑微血管周细胞对亚砷酸钠最敏感。
        综上所述,通过组织分离和酶消化法,可以获得高纯度的原代小鼠脑微血管周细胞,通过逆转录病毒转染LT质粒成功构建了永生化小鼠脑微血管周细胞。该永生化小鼠脑微血管周细胞很有希望作为一种细胞模型广泛应用于脑血管毒物的筛查。

参考文献
[1]QuaegebeurA, SeguraI, CarmelietP. Pericytes: blood-brain barrier safeguards against neurodegeneration?[J]. Neuron, 2010,68(3):321-323. DOI: 10.1016/j.neuron.2010.10.024.
[2]LaiCH, KuoKH. The critical component to establish in vitro BBB model: Pericyte[J]. Brain Res Brain Res Rev, 2005,50(2):258-265. DOI: 10.1016/j.brainresrev.2005.07.004.
[3]KimJA, TranND, LiZ, et al. Brain endothelial hemostasis regulation by pericytes[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006,26(2):209-217. DOI: 10.1038/sj.jcbfm.9600181.
[4]Dore-DuffyP, KatychevA, WangX, et al. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006,26(5):613-624. DOI: 10.1038/sj.jcbfm.9600272.
[5]WangY, PanL, MoensCB, et al. Notch3 establishes brain vascular integrity by regulating pericyte number[J]. Development, 2014,141(2):307-317. DOI: 10.1242/dev.096107.
[6]ArmulikA, GenovéG, M?eM, et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier[J]. Nature, 2010,468(7323):557-561. DOI: 10.1038/nature09522.
[7]RossantJ, CrossJC. Placental development: lessons from mouse mutants[J]. Nat Rev Genet, 2001,2(7):538-548. DOI: 10.1038/35080570.
[8]BandopadhyayR, OrteC, LawrensonJG, et al. Contractile proteins in pericytes at the blood-brain and blood-retinal barriers[J]. J Neurocytol, 2001,30(1):35-44.
[9]饶明俐.中国脑血管病防治指南[M].北京:人民卫生出版社,2007:1-2.
[10]秦伟伟,鹿文葆,刘淑英,等.大鼠脑微血管周细胞的分离和鉴定[J].国际脑血管病杂志,2011,19(7):531-534. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4165.2011.07.008.
[11]蒋骏,孙易,陆垚,等.小鼠胎盘周细胞的原代培养及其在胎盘血管毒物筛查中的初步应用[J].癌变·畸变·突变,2016,28(3):209-213. DOI: 10.3969/j.issn.1004-616x.2016.03.010.
[12]PipasJM. SV40: Cell transformation and tumorigenesis[J]. Virology, 2009,384(2):294-303. DOI: 10.1016/j.virol.2008.11.024.
[13]ChengJ, DeCaprioJA, FluckMM, et al. Cellular transformation by Simian Virus 40 and Murine Polyoma Virus T antigens[J]. Semin Cancer Biol, 2009,19(4):218-228. DOI: 10.1016/j.semcancer.2009.03.002.
[14]GuilarteTR, McGlothanJL. Hippocampal NMDA receptor mRNA undergoes subunit specific changes during developmental lead exposure[J]. Brain Res, 1998,790(1-2):98-107.
[15]UjiharaH, SasaM, BanT. Selective blockade of P-type calcium channels by lead in cultured hippocampal neurons[J]. Jpn J Pharmacol, 1995,67(3):267-269.
[16]WangB, DuY. Cadmium and its neurotoxic effects[J]. Oxid Med Cell Longev, 2013,2013:898034. DOI: 10.1155/2013/898034.
[17]WalvekarRR, KaneSV, NadkarniMS, et al. Chronic arsenic poisoning: a global health issue--a report of multiple primary cancers[J]. J Cutan Pathol, 2007,34(2):203-206. DOI: 10.1111/j.1600-0560.2006.00596.x.
[18]RaiA, MauryaSK, KhareP, et al. Characterization of developmental neurotoxicity of As, Cd, and Pb mixture: synergistic action of metal mixture in glial and neuronal functions[J]. Toxicol Sci, 2010,118(2):586-601. DOI: 10.1093/toxsci/kfq266.