中华预防医学杂志    2018年06期 二代测序技术在一起食源性疾病事件病原鉴定中的初步应用     文章点击量:121    
中华预防医学杂志2018年06期
中华医学会主办。
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汪皓秋 俞骅 郑伟 张蔚 刘涛 楼秀芹 黄春萍 黄利明 沈利明 潘劲草
WangHaoqiu,YuHua,ZhengWei,ZhangWei,LiuTao,LouXiuqin,HuangChunping,HuangLiming,ShenLiming,PanJingcao
二代测序技术在一起食源性疾病事件病原鉴定中的初步应用
Preliminary application of next generation sequencing technique in pathogen identification of foodborne disease
中华预防医学杂志, 2018,52(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.06.015

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投稿日期: 2017-09-12
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二代测序技术在一起食源性疾病事件病原鉴定中的初步应用
汪皓秋 俞骅 郑伟 张蔚 刘涛 楼秀芹 黄春萍 黄利明 沈利明 潘劲草     
汪皓秋 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
俞骅 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
郑伟 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
张蔚 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
刘涛 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
楼秀芹 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
黄春萍 杭州市疾病预防控制中心营养与食品安全所
黄利明 杭州市疾病预防控制中心营养与食品安全所
沈利明 杭州市西湖区疾病预防控制中心监测科
潘劲草 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
摘要: 目的  分析一起食源性疾病事件中病原的基因组学特征。方法  选取事件中死亡病例血样和洗胃前胃内容物,以及其就餐食物作为样品,共11份,对金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌以及有毒物质进行检测,并对食物中检测到的细菌进行计数。采用实时荧光PCR方法检测分离得到的10株蜡样芽胞杆菌的16 S rDNA保守区基因和呕吐毒素ces基因,并采用二代测序技术对分离株进行了基因组测序,初步分析质粒携带情况,并与公共数据库中参考序列进行比较基因组学分析。结果  所有样品中,仅蜡样芽胞杆菌检测阳性,其中蛋炒饭中蜡样芽胞杆菌计数为1.9×107 CFU/g,干炸鱼和卤猪头肉中均为3.0×103 CFU/g。10株分离株均携带hlyⅢ、nheAnheBinlAinhA毒力基因;携带plcRnheC基因的菌株均为9株。分离株16 S rDNA保守区基因和ces基因均为阳性,而且均携带完整的ces基因簇序列,并且与分离自英国的AH187株携带的呕吐毒素质粒pCER270(NC_010924.1)和分离自日本的NC7401株携带的质粒pNCcld(NC_016792.1)的序列完全一致。质粒比对结果显示,分离株序列与炭疽杆菌的pXO1和pXO2质粒差异较大,但携带含ces基因的pNCCld质粒。10株分离株基因组系统发生树显示,10株蜡样芽胞杆菌高度相似(系统发生树上距离为2.0×10-6~9.0×10-6)且与AH187株和NC7401株均高度相似(均属ST26型,系统发生树上距离均为3.8×10-5~4.5×10-5)。结论  本次食源性疾病事件由不携带pXO1、pXO2质粒的呕吐型蜡样芽胞杆菌污染蛋炒饭引起。提示蜡样芽胞杆菌引起呕吐型食物中毒可能与携带ces基因的ST26、ST164等型别菌株相关。
关键词 :病原;基因组学;序列分析;蜡样芽胞杆菌;二代测序
Preliminary application of next generation sequencing technique in pathogen identification of foodborne disease
WangHaoqiu,YuHua,ZhengWei,ZhangWei,LiuTao,LouXiuqin,HuangChunping,HuangLiming,ShenLiming,PanJingcao     
Microbiological Laboratory, Hangzhou Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310021, China
Corresponding author: Pan Jingcao, Email: jingcaopan@sina.com
Abstract:Objective  To analyze genomic features of pathogens based on next generation sequencing technique in a food-borne disease event.Methods  A total of 11 blood samples, stomach contents before gastric lavage from the death and patients' foods were collected. S. aureus, B. cereus and toxic substances were detected. B. cereus detected in foods were counted. The conserved region of 16 S rDNA gene and ces gene(cereulide) of B. cereus isolates were detected by real-time PCR. Next Generation Sequencing (NGS) technology was applied to acquire genome sequences of isolates. Different plasmids distribution and comparative genomics analysis with reference sequences in public databases were analyzed.Results  Only B. cereus tested positive in all samples. The counts of B. cereus in Egg fried rice, one food samples, were 1.9×107 CFU/g, and the counts of B. cereus in dried and fried fish and brine pork head meat samples were 3.0×103 CFU/g both. Ten isolates were carrying hlyⅢ, nheA, nheB, inlA and inhA genes, and nine isolates carried the plcR gene and nine isolates carried the nheC gene. The PCR result of 16 S rDNA gene and ces gene of all isolates were positive. All carried the complete ces genes cluster sequence which were identical to the sequence of plasmid pCER270 (NC_01 0924.1) from strain AH187 in United Kingdom and pNCcld (NC_016792.1) from NC7401 in Japan. The alignment of plasmids turned out the sequence of the isolate differed from the pXO1 and pXO2 plasmids of B. anthracis, but carried the pNCcld plasmid containing the ces genes cluster. The phylogenetic tree based on genomic sequences of ten isolates showed high similarity (distances in phylogenetic tree from 2.0×10-6-9.0×10-6) to each other and to the B. cereus strains AH187 and NC7401 (MLST ST26 type, distances in phylogenetic tree from 3.8×10-5-4.5×10-5).Conclusion  The foodborne disease event was caused by vomiting type Bacillus cereus without plasmid pXO1 and pXO2 contaminated egg fried rice. The vomiting-type food poisoning caused by B. Cereus globally is probably associated with ST26, ST164 and other strains harboring ces gene.
Key words :Noxae;Genomics;Sequence analysis;Bacillus cereus;Next generation sequencing
全文

蜡样芽胞杆菌群由一组遗传相近的细菌组成,主要包括蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌、韦氏芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、假蕈状芽胞杆菌等[1,2],其中蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌基因组高度相似,三者保守序列的一致性可达75%~80%[3,4],其致病性的不同主要是由质粒携带的毒力因子引起[5,6,7]。有研究报道蜡样芽胞杆菌菌株携带编码炭疽毒素的pXO1样质粒,能够引起人和动物患炭疽样疾病[8,9]。2015年4月,杭州市西湖区发生一起由蜡样芽胞杆菌引起的食源性疾病死亡事件。为明确此次事件的病原及了解病原特征,本研究采用具有通量大、用时短、精确度高和信息量丰富等优点的二代测序技术对分离到的10株蜡样芽胞杆菌进行了测序分析,现将结果报告如下。

样本与方法  

1.样本来源及菌株分离:  (1)样本采集:2015年4月,杭州市西湖区发生一起食源性疾病事件。两例病例27日晚共同就餐后发病,其中一人死亡。选取死亡病例血样1份和洗胃前胃内容物2份分别进行毒鼠强、氟乙酰胺、有机磷农药(34种)、总砷、金黄色葡萄球菌及其毒素、蜡样芽胞杆菌的检测;采集患者就餐食物,包括干炸鱼、卤猪头肉和蛋炒饭共8份分别进行金黄色葡萄球菌及其毒素、蜡样芽胞杆菌的检测。(2)菌株分离:按照GB4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》[10]进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定及其肠毒素检测;按照GB4789.14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》[11]进行蜡样芽胞杆菌的分离鉴定及食品中蜡样芽胞杆菌计数。最终分离出10株蜡样芽胞杆菌,编号为HZBC-01~H2BC-10,其基因组序列登录号见表1;金黄色葡萄球菌并未检出。

表110株蜡样芽胞杆菌株基本情况及基因组二代测序数据统计

2.实时荧光PCR检测:  采用实时荧光PCR方法检测菌株的蜡样芽胞杆菌16S rDNA基因和呕吐毒素ces基因,根据TaqMan复合荧光探针设计原则,引物由上海生工合成,探针由大连TaKaRa生物公司合成。扩增蜡样芽胞杆菌16S rDNA基因的上游引物为5'-CCTTATGACCTGGGCTACAC-3',下游引物为5'-AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC-3';TaqMan探针为5'-ROX-TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT-Eclipse-3';扩增蜡样芽胞杆菌呕吐毒素ces基因的上游引物为5'-AATGCGTGAAGGTAGTGAAGA-3',下游引物为5'-TCCCTCGAAATACCTTGCTAAT-3',TaqMan探针为5'-HEX-TCCAAGTACCGTTCCACCTGCCG3'-Eclipse-3'。

3.基因组测序和拼接:  (1)基因组测序:首先,采用QIAamp DNA mini Kit试剂盒(德国Qiagen公司,货号:51304)提取分离株基因组DNA;然后,采用Nextera XT DNA文库构建试剂盒(美国illumina公司,型号:FC-131-1024)进行文库构建;最后,采用Miseq Reagent Kit v3 600cycle试剂盒(美国illumina公司,型号:MS-102-3003)进行基因组测序,以上操作均按试剂盒说明书进行,基因组高通量测序采用illumina Miseq测序平台进行。(2)序列拼接:首先采用Fastqc软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)获得测序reads数据的质控结果;然后采用Trimmomatic软件[12]去除污染的接头序列和低质量序列;最后采用SPAdes软件[13]对数据进行拼接,获得菌株的基因组scaffolds序列。

4.毒力基因检测:  下载毒力因子数据库(Virulence Factors Database, VFDB)[14](http://www.mgc.ac.cn/VFs/),提取出其中芽胞杆菌属的毒力基因序列,采用cd-hit软件[15]构建比对数据库,再采用srst2软件[16]对分离到的10株蜡样芽胞杆菌基因组测序数据进行扫描,获得毒力基因结果。

5.质粒序列比对:  采用BWA软件[17]和SAMtools软件[18]将10株菌株的基因组测序数据分别比对到蜡样芽胞杆菌群菌株所携带的对人致病的3个主要质粒[pXO1(NC_007322.2),pXO2(NC_007323.3)和pNCcld(NC_016792.1)]上,并采用Qualimap软件[19]生成覆盖度图。再采用Mauve软件[20]将10株菌株的基因组拼接片段比对到pNCcld质粒上,并以该质粒顺序为参考,按照顺序排列片段并连锁序列,最后采用BRIG(Blast Ring Image Generator)软件[21]对携带编码呕吐毒素ces基因簇的质粒序列进行序列差异性分析。

6.呕吐毒素基因簇比对:  采用Prokka软件[22]对菌株HZBC-01~HZBC-10的基因组拼接序列进行注释,将呕吐毒素ces基因簇序列提取后,采用Blast(Basic Local Alignment Search Tool)软件进行序列比对,数据库为NCBI非冗余核酸数据库(Nucleotide non-reduntant database)。

7.基因组比较和基因组系统发生树构建:  采用ANI Caculator软件[23]分析10株分离株与分离自英国(AH187)和日本(NC7401)的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌(登录号分别为NC_011658.1和NC_16771.1)的核苷酸平均一致性(Average Nucleotide Identity,ANI),并计算基因组距离。再采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)软件(http://www.github.com/tseemann/mlst)扫描本地分离株和公共数据库中基因组序列获得菌株的MLST型别。然后从Pubmlst网站(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_bcereus_seqdef&page=downloadAlleles)下载蜡样芽胞杆菌群菌株的MLST型别序列数据库,将7个管家基因序列连锁后绘制进化树,选择管家基因进化树中与蜡样芽胞杆菌产毒株NC7401(MLST型别:ST26)相同分支的所有MLST型别,并下载NCBI Assembly数据库中这些型别蜡样芽胞杆菌的基因组序列。最后以蜡样芽胞杆菌产毒株NC7401为参考序列,采用Harvest软件[24]生成基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点序列,使用MAFFT软件进行多重序列比对,并采用RAxML软件和GGTREE软件[25]分别生成系统发育树图和发生树图。

结果  

1.菌株分离计数及有毒物质检测:  (1)菌株检测及分离:从死亡病例洗胃前胃内容物、患者就餐食物样本中共分离鉴定蜡样芽胞杆菌10株,其16S rDNA保守区基因和ces基因均为阳性,基因组测序情况见表1。干炸鱼和卤猪头肉样本中蜡样芽胞杆菌计数均为3.0×103 CFU/g,蛋炒饭样本中为1.9×107 CFU/g,均大于蜡样芽胞杆菌易引起食物中毒的菌量1.0×105 CFU/g[26]。样本中均未检出金黄色葡萄球菌及其毒素。(2)有毒物质检测:死亡病例血样中毒鼠强、氟乙酰胺检测结果均为阴性,洗胃前胃内容物中毒鼠强、氟乙酰胺、有机磷农药(34种)、总砷均为阴性。

2.毒力基因检测:  分离的10株蜡样芽胞杆菌均携带ceshlyⅢ、nheAnheBinlAinhA;除BCE07外,其余9株菌均携带plcR;除BCE-09外,其余9株菌均携带nheC;参考菌株AH187和NC7401均携带ceshlyⅢ、nheAnheBnheCplcRinlAinhA

3.质粒序列比对结果:  (1)与质粒pXO1、pXO2比对:10株菌株的序列数据与质粒pXO1比对后,发现在100~150 kbp区域几乎无覆盖,在其他区域有数据覆盖;与质粒pXO2比对时,存在大量低覆盖和低质量比对序列区域。(2)与质粒pNCcld比对:与质粒pNCcld比对时,数据在全区域覆盖,且各区域覆盖度基本一致。具体比对分析结果见图1

图110株蜡样芽胞杆分离株质粒序列与pNCcld序列比较基因组分析结果

4.呕吐毒素基因簇比对:  10株分离株均携带完整的ces簇基因序列,与分离自英国的蜡样芽胞杆菌AH187携带的呕吐毒素质粒pCER270(NC_010924.1)和分离自日本的蜡样芽胞杆菌NC7401携带的呕吐毒素质粒pNCcld(NC_016792.1)的ces基因簇序列的一致性为100%。

5.基因组比较和基因组系统发生树构建:  10株蜡样芽胞杆菌与分离自英国(AH187)和日本(NC7401)的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌间的ANI值均超过99%。与分离自日本产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌NC7401(MLST型别:ST26)相同分支的还有ST164、ST144等18个MLST型别。构建系统发生树结果显示,10株蜡样芽胞杆菌高度相似(系统发生树上的距离为2.0×10-6~9.0×10-6)且与AH187和NC7401菌株也高度相似(系统发生树上距离均为3.8×10-5~4.5×10-5),该簇菌株大部分均ces基因阳性(图2)。10株菌的MLST型别均为ST26型别。

图2NC7401菌株多位点序列分型型别序列近源的菌株基因组系统发生树

讨论  判断蜡样芽胞杆菌可能为该食源性疾病事件病原的传统依据是:两者有共同进食史,从患者和食物中均检出蜡样芽胞杆菌,菌株均携带有呕吐毒素基因;食物样本(蛋炒饭)中蜡样芽胞杆菌计数大于其易引起食物中毒的菌量(1.0×105 CFU/g)[26];两例患者均出现该杆菌食物中毒的临床特征[27];患者和食物样本中均未检出其他毒物和金黄色葡萄球菌及其毒素。对分离菌株进行基因组学分析,除了可以为事件病原的确定提供更为可靠的证据,还可以更为精细地了解病原菌的分子特征和导致致病的遗传学基础。特别是这起事件中的病例死亡是否与菌株的致病性有关,更需要在细菌基因组水平上加以检视。
        Bazinet [27]通过对蜡样芽胞杆菌泛基因组和核心基因组的分析发现,自然界中该菌各种型别之间进化上差异较大。本研究从大规模Assembly数据中构建基于SNP的进化树时,为避免基因获得和缺失给进化分析带来的不利影响,本研究考虑尽量选择近源的菌株进行进化分析。因此本研究采用先从MLST层面筛选近源菌株,通过MLST管家基因序列的进化树中分离自日本产呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌NC7401(MLST型别:ST26)同支型别,筛选NCBI Assembly数据库的菌株基因组,再选择比对到参考基因组NC7401株来鉴定全基因组水平上的SNP位点,连锁后构建进化树。构建的基因组系统发生树显示,本次食源性疾病事件的10株蜡样芽胞杆菌分离株高度相似,从而在基因组水平上确认了病例分离株和食物分离株间的紧密关系,为本次事件的病原判定提供了更进一步的证据。另外以上菌株在基因组水平上也与分离自英国(AH187)和日本(NC7401)的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌高度相似。本研究进一步发现蜡样芽胞杆菌群菌株MLST管家基因系统发生树中NC7401株所在分支MLST型别主要为ST26、ST164等,这些型别菌株携带ces的比率较高,因此本研究认为在全球范围内由蜡样芽胞杆菌引起的呕吐型食物中毒可能与这些型别菌株相关。质粒序列比对结果显示,本次事件中分离到的10株蜡样芽胞杆菌序列与炭疽杆菌的质粒pXO1、pXO2差异较大,因此可排除此次食源性疾病是由携带编码该种质粒的蜡样芽胞杆菌引起的可能。引起食源性疾病的蜡样芽胞杆菌分为呕吐型菌株和腹泻型菌株,呕吐型菌株一般含有ces[28]。本研究通过与分离自日本产呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌NC7401株的质粒pNCcld比对发现,10株蜡样芽胞杆菌序列数据在全区域覆盖,且各区域覆盖度基本一致,提示其携带有pNCcld样质粒。进一步分析发现,10株分离株均携带完整的ces基因簇序列,与AH187株携带的呕吐毒素质粒pCER270(NC_010924.1)和NC7401株携带的质粒pNCcld(NC_016792.1)的ces基因簇序列完全一致。根据毒力基因携带情况,确定本次食源性疾病事件的病原蜡样芽胞杆菌为呕吐型菌株。
        二代测序技术为本次事件病原的确定提供了可靠的证据,相信在今后的食源性疾病防控中该技术有着良好的应用前景。

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