中华预防医学杂志    2018年06期 小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用     文章点击量:122    
中华预防医学杂志2018年06期
中华医学会主办。
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张婧 梁俊容 段然 秦帅 肖萌 景怀琦 王鑫
ZhangJing,LiangJunrong,DuanRan,QinShuai,XiaoMeng,JingHuaiqi,WangXin
小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用
The effect of AmpD on the expression of AmpC β-lactamase and the regulation mechanisms of β-N-acetylglucosaminidase in Yersinia enterocolitica
中华预防医学杂志, 2018,52(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.06.016

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投稿日期: 2018-03-12
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小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用
张婧 梁俊容 段然 秦帅 肖萌 景怀琦 王鑫     
张婧 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
梁俊容 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
段然 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
秦帅 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
肖萌 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
景怀琦 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
王鑫 102206 北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要: 目的  研究小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶(NagZ)的调控机制及AmpD蛋白对AmpC β-内酰胺酶表达的作用。方法  通过对小肠结肠炎耶尔森菌3个AmpD蛋白同系物(AmpD1~3)基因(ampD1~3)、低分子量青霉素结合蛋白(LMM PBPs)基因(pbp4、pbp5apbp5bpbp7)、NagZ基因(nagZ)以及ampR基因进行敲除或回补,以构建基因突变株,并利用头孢西丁对突变株进行诱导;采用检测头孢硝噻吩水解法测定诱导组和非诱导组突变株AmpC β-内酰胺酶活性(单位为U),采用luxCDABEreporter系统检测AmpC β-内酰胺酶启动子活性[单位为相对光单位(RLU)],采用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为显色底物测定NagZ酶活性(单位nmol/L)。结果  AmpD1蛋白的功能较强,YEΔD1突变株的AmpC β-内酰胺酶表达量出现上升,诱导组和非诱导组分别为(3.29±1.58)和(4.08±1.75)U。YEΔ5b、YEΔ4Δ5b、YEΔ5aΔ5b和YEΔ5bΔ7突变株AmpC β-内酰胺酶启动子活性增强,其中YEΔ4Δ5b突变株活性最高,诱导组和非诱导组分别为(106 903.16±61 910.61)和(205 427.45±45 352.17)RLU。缺失3种基因的菌株中,YEΔ4Δ5bΔ7突变株AmpC β-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为(304 108.04±99 274.53)和(531 440.21±68 891.02)RLU;缺失4种基因的菌株中,YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株AmpC β-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为(1 013 810.99±260 955.96)和(1 230 214.59±205 526.79)RLU;敲除nagZ基因后,YEΔD1D2D3ΔZ突变株AmpC β-内酰胺酶活性未发生明显的变化,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ突变株活性下降明显,诱导组和非诱导组分别为(0.30±0.20)和(0.29±0.21)U,基本降至野生株水平。结论  在肠杆菌科细菌中发现多个AmpD蛋白参与ampC基因的三级调控机制;发现以PBP5b为主,PBP4、PBP5a和PBP7共同参与的ampC基因调控模式;同时还证实了在小肠结肠炎耶尔森菌具有NagZ依赖和非依赖两种ampC基因调控途径。
关键词 :耶尔森菌,小肠结肠炎;青霉素结合蛋白质类;N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶;氨苄青霉素头孢菌素酶;β-N-乙酰葡萄糖胺酶
The effect of AmpD on the expression of AmpC β-lactamase and the regulation mechanisms of β-N-acetylglucosaminidase in Yersinia enterocolitica
ZhangJing,LiangJunrong,DuanRan,QinShuai,XiaoMeng,JingHuaiqi,WangXin     
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Wang Xin, Email: wangxin@icdc.cn
Abstract:Objective  In this study, we analyze the regulation mechanisms of the expression of ampD in AmpC β-lactamase and the regulation mechanism of β-N-acetylglucosaminidase (NagZ) in Yersinia enterocolitica.Methods  We construct the mutation strains of Yersinia enterocolitica AmpD (AmpD1-3) gene (ampD1-3), Low-Molecular-Mass Penicillin-Binding Proteins (LMM PBPs) gene (pbp4, pbp5a, pbp5b, pbp7), NagZ gene (nagZ), and ampR gene by deleting and complementing genes, and induce them by cefoxitin. We determined the activity of AmpC β-lactamase activity (U) of mutant strains (basal level and induce level) by using cephalothiophene hydrolysis method, the promoter activity of AmpC β-lactamase ((relative light unit (RLU)) was detected by the luxCDABEreporter system, and the activity of β-N-acetylglucosaminidase (nmol/L) was determined by by using 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide as the chromogenic substrate.Results  AmpD1 (Basal level: (3.29±1.58) U; Induced level: (4.08±1.75) U) was the most potent one. The YEΔ5b, YEΔ4Δ5b, YEΔ5aΔ5b and YEΔ5bΔ7 of ampC promoter activity increase significantly, whichYEΔ4Δ5b is the highest one (Basal level: (106 903.16±61 910.61) RLU; Induced level: (205 427.45±45 352.17) RLU). The YEΔ4Δ5bΔ7 of ampC promoter activity is the highest among triple mutant strain (Basal level: (304 108.04±99 274.53) RLU; Induced level: (531 440.21±68 891.02) RLU). Quadruple deletion strain YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7 have the highest ampC promoter activity (Basal level: (1 013 810.99±260 955.96) RLU; Induced level: (1 230 214.59±205 526.79) RLU). After the deletion of nagZ gene, there is no significant change in β-lactamase activity of YEΔD1D2D3ΔZ, while β-lactamase activity of YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ shows a significant decrease (Basal level: (0.30±0.20) U; Induced level: (0.29±0.21) U), which basically drops to the wild strain level.Conclusion  This is the first report of ampC multi-step upregulation mechanism driven by three AmpD homologues in Yersinia enterocolitica. The AmpC regulation mode with the function of single PBP4, PBP5a or PBP7 is relatively low, which work in coordination with PBP5b. Yersinia enterocolitica have both NagZ-depend and NagZ-independent mechanisms for β-lactamase expression.
Key words :Yersinia enterocolitica;Gene knockout techniques;N-acetylmuramyl-L-alanine amidase;Ampicillin cephalosporinase;β-N-acetylglucosaminase
全文

小肠结肠炎耶尔森菌染色体ampC编码产生AmpC β-内酰胺酶,它高表达会使细菌对部分青霉素和头孢类抗生素产生天然耐药,从而干扰临床治疗的效果[1,2]。AmpC β-内酰胺酶的表达与细菌细胞壁肽聚糖循环有着密切的关系[3,4],在细胞生长代谢过程中,细菌肽聚糖一直处于分解与合成同时进行的平衡状态,该状态的维持需要数十种酶的参与,这其中包括β-N-乙酰葡萄糖胺酶(β-N-acetylglucosaminidase,NagZ)以及AmpD蛋白、低分子量青霉素结合蛋白(Low molecular mass penicillin binding proteins,LMM PBPs)等。由于细菌内AmpC β-内酰胺酶高表达的前提是NagZ的产物大量堆积于细胞质,所以了解NagZ的调控机制,将有助于控制AmpC β-内酰胺酶的高表达[5]。另外,有研究显示,AmpD蛋白可间接的调控AmpC β-内酰胺酶的表达,一旦编码该蛋白的ampD基因发生突变,便会产生有缺陷的AmpD蛋白,使与其结合的AmpR蛋白(AmpC β-内酰胺酶表达的调节蛋白)处于激活子状态,从而引起AmpC β-内酰胺酶的大量表达[6,7,8,9,10]。而LMM PBPs对小肠结肠炎耶尔森菌AmpC β-内酰胺酶的表达调控机制尚没有相关报道。为了系统的对小肠结肠炎耶尔森菌AmpC β-内酰胺酶表达中的调控机制进行研究,本研究构建了与小肠结肠炎耶尔森菌四种LMM PBPs相关的基因及AmpD蛋白同系物基因的单和(或)多重缺失菌株,并检测了其AmpC β-内酰胺酶的启动子活性,以此探讨AmpC β-内酰胺酶表达及NagZ的调控机制。现将结果报告如下。

材料与方法  

1.菌株:  本研究所用1株小肠结肠炎耶尔森菌野生株YE105.5R(r)为本实验室保存并完成测序[11];质粒pDS132、pBBRLux,大肠埃希菌(S17 λpir和DH5α)均根据文献[12,13,14]中方法制备;引物设计的参考菌株为全测序株小肠结肠炎耶尔森菌古北亚种105.5R(r)[6],具体见表1。采用Luria-Bertani(LB)琼脂平板和LB肉汤培养基培养小肠结肠炎耶尔森菌(28 ℃)和大肠埃希菌(37 ℃)。

表1引物序列、产物长度及用途

2.主要试剂与仪器:  (1)试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒和质粒小提中量试剂盒购自天根生化(北京)有限公司;PCR纯化试剂盒购自美国Omega公司;Q5超保真Mix和限制性内切酶购自NEB(北京)公司;pEASY无缝克隆试剂盒购自北京全式金生物公司;化学感受态制备试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;QIAquick Gel Extraction Kit购自德国Qiagen公司。(2)仪器:Quset Labcycler温度梯度PCR仪购自德国SENSO公司;凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司;核酸浓度测定仪购自美国NanoDrop公司;VITEK 2 compact购自法国梅里埃公司;Tecan infinite 200酶标仪购自瑞士Tecan公司;SONICSVC750超声破碎仪购自美国SONICS公司。

3.AmpD蛋白同系物的系统发育树分析:  使用MEGA软件,进行系统发育树分析,分别将大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、铜绿假单胞菌的AmpD蛋白氨基酸序列与小肠结肠炎耶尔森菌AmpD蛋白氨基酸序列进行比对。美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)编码如下:小肠结肠炎耶尔森菌AmpD1(WP_005156822)、AmpD2(WP_005164953.1)、AmpD1(WP_013649890.1)蛋白;大肠埃希菌K-12AmpD蛋白(AAC73221)、弗劳地枸橼酸杆菌OS60 AmpD蛋白(Z14002)、阴沟肠杆菌ATCC13047 AmpD蛋白(CAA78391),非肠杆菌科细菌AmpD(绿脓杆菌PAO1,no.NP_253211.1),AmpDh2(绿脓杆菌PAO1,no.NP_254172)和绿脓杆菌PAO1 AmpDh3(no.NP_249498)蛋白。

4.突变株的构建:  (1)基因缺失菌株:参照文献[15,16,17]构建基因敲除突变株,通过无缝克隆技术将目的基因的上、下游同源臂连接至自杀质粒敲除载体pDS132上,再通过无痕敲除技术构建相关目的基因缺失菌株。用菌落PCR法鉴定染色体缺失突变体的正确性。(2)基因回补菌株:使用T4快速连接酶将ampD1、ampD2和ampD3基因的CDS区域DNA片段与经酶切线性化的回补质粒pSRKTc相连接,并转化大肠埃希菌S17λpir。在成功构建ampD1、ampD2、ampD3基因回补质粒pSRKTcD1、pSRKTcD2、pSRKTcD3后,分别将上述质粒转化到三基因缺失菌株YEΔD1D2D3中。并添加异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导回补基因进行过量表达。具体基因缺失菌株和回补菌株以编号形式命名,见表2

表2小肠结肠炎耶尔森菌基因缺失菌株和回补菌株的突变类型

5.AmpC β-内酰胺酶启动子活性的测定:  利用luxCDABEreporter系统检测AmpC β-内酰胺酶启动子活性,具体方法参见文献[15]。将重组质粒pLUXampC转入基因缺失菌株YEΔD1、YEΔD2、YEΔD3、YEΔD2D3、YEΔD1D2、YEΔD1D3、YEΔD1D2D3、YEΔ4、YEΔ5a、YEΔ5b、YEΔ7、YEΔ4Δ5a、YEΔ4Δ5b、YEΔ4Δ7、YEΔ5aΔ5b、YEΔ5aΔ7、YEΔ5bΔ7、YEΔ4Δ5aΔ5b、YEΔ4Δ5aΔ7、YEΔ4Δ5bΔ7、YEΔ5aΔ5bΔ7、YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7中,使用Infinite M200 Pro分光光度计在600 nm波长的条件下测定吸光度值。诱导组为试验菌株中加入40 μg/ml头孢西丁诱导剂,未诱导组不添加诱导剂。每组均进行3次独立实验,每次实验读数3次。

6.AmpC β-内酰胺酶活性的测定:  用头孢硝噻吩水解法测定野生株YE105.5R(r),基因缺失菌株YEΔD1、YEΔD2、YEΔD3、YEΔD2D3、YEΔD1D2、YEΔD1D3、YEΔD1D2D3、YEΔD1D2D3ΔZ、YEΔD1D2D3ΔR、YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7、YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ、YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔR,和基因回补菌株YEΔD1D2D3(pSRKTc)、YEΔD1D2D3(pSRKD3)、YEΔD1D2D3(pSRKD2)、YEΔD1D2D3(pSRKD1)、YEΔD1D2D3ΔZ(pNagZ)、YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ(pNagZ)的AmpC β-内酰胺酶活性[15]。具体方法:取指数增长末期的细胞5 ml超声破碎保留上清液,再用头孢硝噻作为显色底物监测AmpC β-内酰胺酶活性,聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白浓度检测法(butyleyanoacrylate,BCA)测定每个样品的蛋白浓度。诱导组为试验菌株中加入40 μg/ml头孢西丁诱导剂,未诱导组不添加诱导剂。每组均进行3次独立实验,每次实验读数3次。

7.NagZ酶活性的测定:  使用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为显色底物测定野生株YE105.5R(r)和nagZ基因缺失菌株YEΔZ的NagZ酶活性。具体方法:将隔夜培养物按1∶100稀释至LB肉汤培养基中,28 ℃振摇培养7 h,超声破碎后收集500 μl上清液,加入500 μl浓度为1 mmol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷,温和混匀。使用酶标仪在405 nm波长的条件下,对野生株YE105.5R(r)和nagZ基因缺失菌株YEΔZ的显色吸光度进行连续10 h的检测。每组均进行3次独立实验,每次实验读数3次。

结果  

1.AmpD蛋白氨基酸序列系统发育树:  如图1所示,AmpD蛋白同系物的基因组发育树分为两个大分支,第一个大分支由大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、铜绿假单胞菌的AmpD蛋白和小肠结肠炎耶尔森菌AmpD1蛋白组成,第二个大分支由铜绿假单胞菌的AmpDh2蛋白、AmpDh3蛋白和小肠结肠炎耶尔森菌AmpD2蛋白、AmpD3蛋白组成。

图1小肠结肠炎耶尔森菌AmpD蛋白同系物及其他革兰阴性细菌已知AmpD蛋白氨基酸序列系统发育树

2.AmpD蛋白同系物基因缺失菌株的AmpC β-内酰胺酶启动子活性:  如表3所示,野生株YE105.5R(r)只具有较低的AmpC β-内酰胺酶表达水平,未诱导和诱导组分别为(2 638.66±494.60)和(34 763.73±12 810.91)相对光单位(relative light unit,RLU)。而YEΔD1突变株的AmpC β-内酰胺酶启动子活性显著提高,未诱导和诱导组分别为(390 473.16±142 100.06)和(351 425.98±104 665.54)RLU,而YEΔD2和YEΔD3突变株的AmpC β-内酰胺酶表达水平与野生株相比并没有明显变化。在双基因缺失菌株中,YEΔD1D2和YEΔD1D3突变株均具有较高的AmpC β-内酰胺酶启动子活性,其中YEΔD1D2突变株的未诱导和诱导组活性分别为(852 529.71±140 326.29)和(838 660.72±141 670.86)RLU,YEΔD1D3突变株分别为(1 643 172.94±97 578.87)和(1 387 640.23±152 413.71)RLU;而YEΔD2D3突变株则与野生株YE105.5R(r)相比差别不大;缺失3种基因的菌株YEΔD1D2D3的AmpCβ-内酰胺酶启动子活性与YEΔD1D3突变株处于相同水平。

表3小肠结肠炎耶尔森菌ampD基因缺失菌株头孢西丁诱导组和未诱导组的AmpC β-内酰胺酶启动子活性(±sn=9)

3.AmpD蛋白同系物基因缺失菌株和回补菌株的AmpC β-内酰胺酶活性:  (1)基因缺失菌株:AmpC β-内酰胺酶活性实验结果与AmpC β-内酰胺酶启动子活性实验结果基本相符,但有两点不同:YEΔD1D2D3突变株的AmpC β-内酰胺酶活性低于YEΔD1D3突变株,其中YEΔD1D2D3突变株未诱导和诱导组分别为(10.69±1.49)和(9.79±2.85)U,YEΔD1D3突变株未诱导和诱导组(10.88±1.22)和(9.80±1.98)U;YEΔD1D3和YEDΔ1D2D3突变株在加入诱导剂后AmpC β-内酰胺酶活性反而略有下降。(2)基因回补菌株:AmpD1和AmpD2蛋白回补菌株AmpC β-内酰胺酶活性基本上恢复了野生株的水平;而AmpD3蛋白回补菌株AmpC β-内酰胺酶活性仍高于野生株,AmpD3回补菌株未诱导和诱导组分别为(1.58±0.42)和(1.64±0.30)U,而野生株未诱导和诱导组仅分别为(0.32±0.17)和(0.51±0.14)U。详见表4

表4小肠结肠炎耶尔森菌ampD基因缺失菌株和回补菌株头孢西丁诱导组和未诱导组AmpC β-内酰胺酶活性(±sn=9)

4.LMM PBPs对小肠结肠炎耶尔森菌AmpC β-内酰胺酶启动子活性及AmpC β-内酰胺酶活性的影响:  (1)对AmpC β-内酰胺酶启动子活性的影响:如表5所示,在YEΔ4、YEΔ5a和YEΔ7中AmpC β-内酰胺酶启动子活性基本与野生株水平相一致,而YEΔ5b突变株的AmpC β-内酰胺酶启动子活性明显增强,未诱导和诱导组分别为(30 843.81±17 325.98)和(59 889.68±9 781.10)RLU,而野生株未诱导和诱导组分别为(2487.67±13.06)和(5 551.11±1 862.95)RLU。在双基因缺失菌株中,YEΔ4Δ5b突变株的AmpC β-内酰胺酶启动子活性上升最明显,未诱导和诱导组AmpC β-内酰胺酶启动子活性分别为(106 903.16±61 910.61)和(205 427.45±45 352.17)RLU。在三基因缺失菌株中,只有YEΔ4Δ5aΔ7突变株维持了野生株的水平,其余AmpC β-内酰胺酶启动子活性从高到低排列分别为突变株YEΔ4Δ5bΔ7,YEΔ4Δ5aΔ5b和YEΔ5aΔ5bΔ7。四基因缺失菌株YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7的AmpC β-内酰胺酶启动子活性最高,未诱导和诱导组分别为(1 013 810.99±260 955.96)和(1 230 214.59±205 526.79)RLU。(2)对AmpC β-内酰胺酶活性的影响:YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株的AmpC β-内酰胺酶活性与YE105.5R(r)野生株相比有较大幅度的提高,与YEΔD1D2D3突变株相比,AmpC β-内酰胺酶活性相对较低,但两者的AmpC β-内酰胺酶活性都不能再被诱导剂诱导所升高。

表5敲除低分子量青霉素结合蛋白基因后小肠结肠炎耶尔森菌头孢西丁诱导组和未诱导组AmpC β-内酰胺酶启动子活性(±sn=9)

5.nagZampR基因缺失对突变株AmpC β-内酰胺酶活性的影响:  本研究构建的YEΔD1D2D3和YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株相比较于野生株YE105.5R(r)均具有很高的AmpC β-内酰胺酶活性,YEΔD1D2D3突变株未诱导和诱导组分别为(6.13±1.25)和(5.83±1.85)U,YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株未诱导和诱导组分别为(3.97±1.43)和(3.89±1.76)U,而野生株未诱导和诱导组仅分别为(0.23±0.03)和(1.24±0.39)U。因此本研究分别对两个ampC基因过表达菌株的nagZ基因进行敲除,敲除后YEΔD1D2D3ΔZ突变株的AmpC β-内酰胺酶活性没有发生明显的变化,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ突变株则出现了大幅度下降,基本降至野生株水平(表6)。AmpR蛋白对于YEΔD1D2D3和YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株的ampC基因过表达至关重要,敲除ampR基因后,使两种细菌的AmpC β-内酰胺酶活性急剧下降。

表6不同特征小肠结肠炎耶尔森菌头孢西丁诱导组和未诱导组AmpC β-内酰胺酶活性(±sn=9)

6.NagZ酶活性检测:  与野生株相比,YEΔZ突变株完全失去了NagZ酶活性。详见表7

表7小肠结肠炎耶尔森菌野生株和突变株不同时间下β-N-乙酰葡萄糖胺酶活性(±sn=9)

讨论  AmpD蛋白一直在抑制细菌ampC基因过表达中起到重要的作用。作为肠杆菌科细菌的一员,小肠结肠炎耶尔森菌在基因序列上具有典型的ampR-ampC结构域,本研究首次对小肠结肠炎耶尔森菌AmpD蛋白同系物功能进行系统研究,首次对肠杆菌科细菌ampC基因三级调控机制进行描述,打破了该机制只存在于铜绿假单胞菌中的旧观念。本研究结果显示,小肠结肠炎耶尔森菌AmpD蛋白三个同系物由一个功能较强的AmpD1蛋白和两个功能较弱的AmpD2和AmpD3蛋白组成。ampD2和ampD3基因生物学功能较弱,与之相关的单、双基因缺失菌株都只能轻微提高ampC基因的表达量,而ampD2和ampD3基因分别与ampD1基因构建的双基因缺失菌株YEΔD1D2和YEΔD1D3,其ampC基因表达量会不同程度的大幅度上升,特别是YEΔD1D3突变株已经达到了完全去阻遏表型,AmpC β-内酰胺酶活性高于三基因缺失菌株YEΔD1D2D3。
        事实上PBPs、NagZ和AmpR蛋白在肠杆菌科细菌ampC基因调控中起的作用还不是很清楚[18,19],尤其小肠结肠炎耶尔森菌并不是传统的高耐药细菌,对于大多数抗生素敏感也很少报道获得耐药质粒,但对其ampC基因调控机制的深入研究有助于完善人们对整个肠杆菌科细菌的了解。众所周知,PBPs是一组在细胞壁循环和AmpC β-内酰胺酶调控中都起到重要作用的酶,因其可被AmpC β-内酰胺类抗生素结合而得名,在铜绿假单胞菌中和大肠埃希菌中都有过研究。在本研究中,我们首次发现PBP5b(而不是PBP4)是小肠结肠炎耶尔森菌中调控ampC基因表达最关键的PBPs,单独缺失PBP4,PBP5a或PBP7并不影响细菌AmpC β-内酰胺酶启动子活性,只有在PBP5b缺失的背景下才能发现这三种PBPs在ampC基因的调控中起到不同程度的作用。这说明在小肠结肠炎耶尔森菌中,存在着以PBP5b为主,PBP4,PBP5a和PBP7与其产生协同效应的ampC基因调控机制。
        AmpR蛋白诱导AmpC β-内酰胺酶表达作用依赖于细胞质内细胞壁降解产物和胞壁质前体的水平。AmpR蛋白作为ampC基因的转录激活因子,其失活导致ampC基因不能诱导表达。随着AmpC β-内酰胺酶调控机制研究的深入,越来越多的证据表明细菌通过两条不同的途径对ampC基因的表达进行调控,其中一条途径需要NagZ的参与,而另一条途径不需要NagZ的参与。有研究发现有两种不同的激活剂配体参与嗜麦芽窄食单胞菌AmpC β-内酰胺酶的调控[20]。本研究在小肠结肠炎耶尔森菌中发现了与嗜麦芽窄食单胞菌相反的AmpC β-内酰胺酶调控机制,敲除nagZ基因后,YEΔD1D2D3突变株的AmpC β-内酰胺酶活性不受影响,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株的AmpC β-内酰胺酶活性降至野生株水平,说明AmpD蛋白同系物缺失所致的ampC基因过表达过程不需要NagZ的参与,而且由于YEΔZ突变株完全失去了水解对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的能力,判断这种未知的酶并没有NagZ酶活性。
        综上所述,本研究发现了小肠结肠炎耶尔森菌独特的LMM PBPs-NagZ依赖和AmpD-NagZ非依赖的ampC基因调控机制,为其他革兰阴性细菌ampC调控研究奠定了基础。

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