中华预防医学杂志    2018年08期 补体因子CD55启动子区多态影响食管癌发病的相关性    PDF     文章点击量：240    
中华预防医学杂志2018年08期
中华医学会主办。
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仵红娇 高慧 谢俞宁 张艳艳 杨振邦 张雪梅
WuHongjiao,GaoHui,XieYuning,ZhangYanyan,YangZhenbang,ZhangXuemei
补体因子CD55启动子区多态影响食管癌发病的相关性
A promoter polymorphism of CD55 effect on the risk of esophageal cancer
中华预防医学杂志, 2018,52（8）
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.08.009

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投稿日期: 2018-01-31
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补体因子CD55启动子区多态影响食管癌发病的相关性
仵红娇 高慧 谢俞宁 张艳艳 杨振邦 张雪梅     
仵红娇 063000　河北，华北理工大学生命科学学院
高慧 063000　河北，华北理工大学生命科学学院
谢俞宁 063000　河北，华北理工大学生命科学学院
张艳艳 063000　河北，华北理工大学生命科学学院
杨振邦 063000　河北，华北理工大学生命科学学院
张雪梅 063000　河北，华北理工大学生命科学学院
收稿日期: 2018-01-31
通信作者：张雪梅，Email：jyxuemei@gmail.com
摘要: 目的  探讨补体因子CD55启动子遗传变异与食管癌发病风险的相关性。方法  以2008年4月至2012年12月在华北理工大学附属唐山市工人医院和唐山市人民医院就诊的700例食管癌患者作为病例组，健康对照来自同期健康体检个体，以无肿瘤病史和体征者作为对照组，共700名。采用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法，对700例食管癌患者和700名正常对照者进行CD55 rs2564978基因分型。采用非条件logistic回归模型比较CD55 rs2564978变异与食管癌发病风险的关系。结果  病例组和对照组的年龄分别为（60.04±9.19）、（59.21±9.98）岁。与CD55 rs2564978 TT基因型携带者相比，CC基因型携带者患食管癌OR（95%CI）为1.94（1.42~2.66）；不同性别分析显示，携带CC基因型的男、女性与食管癌发病的OR（95%CI）分别为1.92（1.37~2.70）、2.34（1.04~5.27）；不同年龄组中，≤60、>60岁CC基因型携带者与食管癌发病的OR（95%CI）分别为1.79（1.19~2.68）、2.32（1.41~3.83）。同时，在调整了其他变量后，饮酒、不饮酒的CC基因型携带者与食管癌发病的OR（95%CI）分别为1.93（1.03~3.63）、1.95（1.36~2.80）。吸烟状况分层分析显示，与CD55 rs2564978 TT基因型相比，CC基因型中的非吸烟人群、累计吸烟量≤30包/年、累计吸烟量>30包/年的人群食管癌发病的OR（95%CI）分别为1.79（1.13~2.83）、1.86（1.31~2.64）和2.67（1.28~5.57）。吸烟和CD55 rs2564978通过交互作用影响食管癌发病风险（P=0.001）。结论  CD55启动子区rs2564978遗传变异可能与食管癌发病相关。
关键词 :抗原;遗传变异;食管癌;单核苷酸多态;补体因子
A promoter polymorphism of CD55 effect on the risk of esophageal cancer
WuHongjiao,GaoHui,XieYuning,ZhangYanyan,YangZhenbang,ZhangXuemei     
College of Life Science, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China
Corresponding author:Zhang Xuemei, Email: jyxuemei@gmail.com
Abstract:Objective  This study aimed to investigate the relationship between the genetic variation of CD55 promoter and the risk of esophageal cancer.Methods  A total of 700 esophageal cancer patients recruited between April 2008 and December 2012 at Tangshan Grongren Hospital and Tangshan Renmin Hospital, and 700 frequency matched controls were randomly selected from a pool of cancer free subjects recruited from a nutritional survey. Genotypes of CD55 rs2564978 polymorphism among all subjects were conducted by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The OR and 95%CI were calculated by non-conditional Logistic regression to evaluate the association of CD55 rs2564978T/C polymorphism with the risk of esophageal cancer.Results  The average age of cases and control was (60.04±9.19) and (59.21±9.98) years old. Compared with CD55 rs2564978 TT carriers, the individuals with CC genotype had a significantly higher risk of esophageal cancer (OR=1.94, 95%CI:1.42-2.66) . When stratified by sex, this genetic variation affected the risk of esophageal cancer among both males (OR=1.92, 95%CI:1.37-2.70) and females (OR=2.34, 95%CI:1.04-5.27). When stratified by age, the CD55 rs2564978 CC was associated with the susceptibility of developing esophageal cancer among younger individuals (OR=1.79, 95%CI:1.19-2.68) and older people (OR=2.32, 95%CI:1.41-3.83).When stratified by drinking status, CC genotype carriers increase the risk of esophageal cancer when drinking (OR=1.93, 95%CI:1.03-3.63) or not drinking (OR=1.95, 95%CI:1.36-2.80). When stratified by smoking status, CC genotype was associated with the risk of esophageal cancer among non-smokers (OR=1.79, 95%CI: 1.13-2.83), light smokers (less than 30 packs/year, OR=1.86, 95%CI:1.31-2.64) and heavy smokers (more than 30 packs/year, OR=2.67, 95%CI:1.28-5.57). Gene-environmental interaction analysis showed that CD55 rs2564978T/C polymorphism interacted with smoking status to increase the risk of esophageal cancer.Conclusion  CD55 rs2564978 polymorphism effects on the risk of esophageal cancer.
Key words :Antigens;Genetic variation;Esophageal cancer;Single nucleotide polymorphism;Complement factor
全文

食管癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，严重影响我国人民的健康和生存质量[1,2,3]。补体系统是机体在对抗感染的免疫应答过程中不可缺少的一类蛋白质。在恶性肿瘤形成过程中，由慢性炎症形成的微环境富集了各种细胞因子等炎症介质，从而为肿瘤细胞的恶性转化增殖创造了条件，因而有利于肿瘤的发生和发展。此外，由炎症反应所诱导的补体激活可调节抗肿瘤免疫反应，提供有利于肿瘤生长的微环境，从而促进肿瘤生长[4,5]。补体因子CD55，又称为衰变加速因子（decay accelerating factor，DAF），是糖苷二磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI）锚定的补体膜抑制剂，抑制C3/C5转化酶的形成并促进其分解代谢[6,7]。研究发现，CD55在多种肿瘤细胞中表达异常[8,9]，因此常用作为癌症疫苗的靶标[10]。笔者前期研究发现，CD55启动子区rs2564978 T/C遗传变异可以影响CD55的转录活性，并能增加非小细胞肺癌的发病风险[11]。鉴于CD55在肿瘤发生发展过程中的重要作用，本研究采用病例-对照研究方法，探讨CD55 rs2564978 T/C遗传变异对食管癌发病风险的影响。

对象与方法  

一、对象  2008年4月至2012年12月收集700例在华北理工大学附属唐山市工人医院和唐山市人民医院就诊的食管癌患者，术前未进行放射或化学治疗。同时选择700名同时期在唐山市区进行健康体检的人群作为健康对照，无既往肿瘤史和体征。通过查阅病历资料和问卷调查的方式获取研究对象性别、年龄、吸烟及饮酒情况等一般人口学资料及临床资料。所有研究对象均知情同意，并提供外周静脉血2 ml，用于基因组DNA提取。本研究获得华北理工大学伦理委员会批准（2016347)。

二、基因分型  采用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法，对所有调查对象进行CD55 rs2564978 T/C遗传变异基因分型。PCR引物分别为正义引物：5'-ATGAACAATGTTCACTCCCTACTGTGGTA-3'，反义引物：5'-TAAGGAGGAAGGGCGTCATC-3'，其扩增产物为101 bp。在6 μl的PCR反应体系中，上下游引物各1 μmol，1×Taq PCR混合液，基因组DNA约1~20 ng。PCR反应程序为：经94 ℃ 3 min预变性后，反应混合物于94 ℃ 40 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s经历32个循环，最后于72 ℃ 3 min。PCR产物经限制性内切酶RsaI（英国New England Biolabs公司）于37 ℃水浴后，在质量分数为3%琼脂糖凝胶中电泳分离。由于含有rs2564978C等位基因的PCR产物含有RsaI酶切位点而产生79 bp和22 bp两个片段；含rs2564978T等位基因者则只产生101 bp一个片段。随机挑选10%样本进行重复实验，所有结果完全一致。

三、质量控制  本研究收集的问卷严格规定填写要求和注意事项，并且有专人负责质量控制，研究对象基本信息核实无误后录入数据库并将采集的血液样本依次编号。并且抽取10%样本进行重复实验。每次PCR实验均设置对照孔，避免实验假阴性或假阳性。

四、统计学分析  使用SPSS 17.0软件进行数据分析，采用χ2检验比较病例组和对照组中性别、年龄和吸烟状况的分布差异。由于对照组年龄中位数为60岁，故以60岁为界分为两组。采用非条件logistic回归模型分析（包括共显性模型、显性模型和隐性模型）CD55遗传变异与食管癌发病风险的关系。CD55基因型与吸烟的交互作用采用相乘模式进行分析。使用M-H法（Mantel-Haenszel）进行异质性检验。所有统计检验均为双侧概率检验。基因-环境交互作用分析使用GDMR软件（V0.7），异质性检验使用Review Manager 5.3软件。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

一、基本特征  研究对象的基本特征如表1所示，在病例组和对照组中，性别和年龄分布差异均无统计学意义（P>0.05）。病例组和对照组中吸烟者分别为448例（64.0%）和278名（39.7%），差异有统计学意义（P<0.001）。病例组和对照组中轻度吸烟者和重度吸烟者的分布差异无统计学意义（P=0.541）。病例组和对照组中饮酒情况的分布差异有统计学意义（P=0.027）。

表1食管癌病例组和对照组的基本人口学特征
表选项

二、CD55 rs2564978遗传变异与食管癌发病风险  CD55 rs2564978各基因型在食管癌病例组和对照组中的分布见表2。CD55 rs2564978各基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2=0.32，P=0.572）。调整性别、年龄、吸烟、饮酒后，进一步分析启动子区rs2564978基因型分布在病例组和对照组的差异。显性模型和隐性模型研究显示，rs2564978多态性与食管癌发病有关联（P值均<0.05）。共显性模型显示，CC基因型与食管癌的发病相关（P<0.001），而CT基因型与食管癌的发病无关（P=0.330）。

表2CD55 rs2564978遗传变异与食管癌发病风险的logistic回归模型的分析
表选项

三、CD55 rs2564978遗传变异与食管癌发病风险关系分层分析  为进一步分析CD55 rs2564978遗传变异与食管癌发病风险的关系，本研究进行了性别、年龄、吸烟和饮酒状况分层分析（表3）。其中对照组年龄中位数为60岁，故以60岁为界分为两组。性别分层分析显示，与CD55 rs2564978 TT基因型携带者相比，携带CC基因型与食管癌的发病相关。基因和吸烟共同作用时，交互作用P值为0.001，说明吸烟和CD55 rs2564978可交互作用影响食管癌发病风险。异质性检验未发现不同亚组差异存在统计学意义（P>0.05）。

表3不同亚组调查对象中CD55 rs2564978遗传变异分布及非条件logistic回归模型分析
表选项

讨论  流行病学研究表明，食管癌的发生不仅与环境因素有关，也与个体的遗传易感性有着密切的关系[12]。膜结合补体调节蛋白（membrane-bounal complement regulatory proteins，mCRPs）可以作用于补体激活级联的不同阶段，保护宿主细胞以及组织免受补体激活的损伤[13,14]。在肿瘤细胞表面mCRPs的异常表达可能导致肿瘤细胞逃逸免疫监视进而引起肿瘤的恶性发展[15,16]。CD55作为mCRPs家族中的重要一员，可以作为CD97的配体存在，在肿瘤去分化、迁移和侵袭中发挥重要的作用[17,18]。CD55是一种细胞相关的C3和C5转化酶调节剂，通过加速C3和C5转化酶的衰变优先作用于补体激活的经典途径，从而使自身细胞免受补体攻击[19,20]。
        在肿瘤细胞中补体系统关键调节蛋白的表达异常与肿瘤的发生发展密切相关。Shimo等[8]研究发现，和正常食管黏膜相比，食管癌细胞中CD55的表达显著降低。先前笔者研究发现，rs2564978的最小等位基因频率为0.419[11]。本研究中CD55 rs2564978的基因型频率分布符合H-W遗传平衡定律（P>0.05），样本具有群体代表性。HapMap中rs2564978的最小等位基因频率在非洲、美洲、亚洲和欧洲人群中分别为0.98、0.72、0.41和0.75。本研究中的rs2564978的最小等位基因频率同样为0.419，与HapMap中亚洲人群分布特点相符合。rs2564978位于基因的启动子区，使用转录因子数据库中的分析软件TRANSFAC预测发现rs2564978 T/C变异增加了转录因子C/EBP α的结合，从而可能影响CD55基因的表达。先前笔者研究了CD55 rs2564978遗传变异与肺癌易感性之间的关系，发现CD55 rs2564978遗传变异与肺癌发病风险相关，携带CD55基因遗传改变的人群可能增加非小细胞肺癌的发病风险，采用双荧光素酶报告基因实验进行研究，发现CD55 rs2564978T/C遗传变异使CD55转录活性降低从而可能影响CD55基因的表达[11]。本研究中笔者发现CD55 rs2564978 T/C变异增加食管癌的发病风险。这可能与食管癌细胞通过调节补体活性而抵抗补体介导的免疫攻击有关。这和笔者先前在胃癌和非小细胞肺癌中的研究结果一致，CD55遗传变异可显著增加个体罹患胃癌和非小细胞肺癌的发病风险[11,21]。
        吸烟是食管癌发病的危险因素之一，烟草中含有许多有毒或致癌物质[22]，这些致癌物的代谢产物可能导致基因突变从而诱导肿瘤的发生[23]。香烟烟雾可以诱导C3和C5裂解，进一步激活补体的替代途径[17,18]。作为C3和C5补体因子的关键调节因子，吸烟可能通过影响CD55而影响食管癌发病风险。笔者对CD55 rs2564978 T/C变异与食管癌发病风险关系进行了吸烟分层分析，结果显示，携带CD55 rs2564978CC基因型的吸烟者，特别是重度吸烟者，要比非吸烟者罹患食管癌的风险更大。说明，吸烟可以和该遗传变异交互作用共同增加个体罹患食管癌的发病风险。
        该研究发现CD55启动子遗传变异可能影响食管癌的遗传易感性，这进一步证实了补体系统在肿瘤发生发展中的作用。

参考文献
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