中华预防医学杂志    2018年08期 CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性与乳腺癌发病风险及临床病理特征的关系    PDF     文章点击量:300    
中华预防医学杂志2018年08期
中华医学会主办。
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杜正贵 王刘艳 周毅 万航宇 梁法清 吕青
DuZhenggui,WangLiuyan,ZhouYi,WanHangyu,LiangFaqing,LyuQing
CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性与乳腺癌发病风险及临床病理特征的关系
Association of CYP19A1 gene rs7176005 single nucleotide polymorphism with breast cancer risk and clinicopathologic features of tumor
中华预防医学杂志, 2018,52(8)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.08.010

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投稿日期: 2017-10-10
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CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性与乳腺癌发病风险及临床病理特征的关系
杜正贵 王刘艳 周毅 万航宇 梁法清 吕青     
杜正贵 610041 成都,四川大学华西医院乳腺外科
王刘艳 成都市郫县中医医院外一科
周毅 四川省人民医院乳腺外科
万航宇 610041 成都,四川大学华西医院乳腺外科
梁法清 610041 成都,四川大学华西医院乳腺外科
吕青 610041 成都,四川大学华西医院乳腺外科
摘要: 目的  了解CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性与乳腺癌发生及临床病理特征的关系。方法  研究对象来自四川大学华西医院2012年9月至2016年11月乳腺科患者或者体检人员,分为乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组和对照组,其中乳腺癌病例组共138例,即术后常规石蜡切片确诊为原发性乳腺癌患者;乳腺良性疾病组共293例,即同时期门诊彩超提示为乳腺实性包块,经穿刺诊断为纤维腺瘤或者腺病的患者,按年龄±5岁与乳腺癌病例组匹配;对照组共259名,即同期门诊体检的健康女性,未发现乳腺相关疾病,按年龄±5岁与乳腺癌病例组匹配。采用直接测序法分析研究对象CYP19A1基因rs7176005单核苷酸的多态性,采用Hardy-Weinberg检验分析3组基因型的遗传平衡性,采用χ2检验分别比较3组间rs7176005位点基因型的分布差异以及携带不同基因型乳腺癌病例组对象间临床病理特征的差异。结果  乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组和对照组研究对象年龄分别为(44.69±8.09)、(42.33±11.44)和(41.92±9.61)岁。Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验结果显示,乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组和对照组对象等位基因C和T的构成比差异均无统计学意义(χ2值分别为0.83、0.34、0.04,P值分别为0.363、0.561、0.852),即3组对象均符合遗传平衡,具有衡定性及群体代表性。138例乳腺癌病例中,CYP19A1基因rs7176005位点不同基因型的患者肿瘤大小分布差异有统计学意义(χ2=10.66,P=0.031),其中,携带TT和CT基因型的患者肿瘤大小以≤2 cm为主,比例分别为12/16和58%(40例),而携带TT基因型者以>2且≤5 cm为主,比例为51%(27例);不同基因型患者间临床分期的分布差异有统计学意义(χ2=11.19,P=0.025),携带CC和CT基因型者以Ⅱ期为主,比例分别为45.3%(24例)和52.2%(36例),携带TT基因型者以Ⅰ期为主,比例为9/16。结论  CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性与乳腺癌发病无相关性,但含C等位基因的乳腺癌患者肿瘤增殖较快,发病时肿瘤也较大。
关键词 :多态性,单核苷酸;乳腺肿瘤;病理学;CYP19A1
Association of CYP19A1 gene rs7176005 single nucleotide polymorphism with breast cancer risk and clinicopathologic features of tumor
DuZhenggui,WangLiuyan,ZhouYi,WanHangyu,LiangFaqing,LyuQing     
Department of Breast Surgery, West China Hospital of Sichuan University, Sichuan 610041, China
Corresponding author: Lyu Qing, Email: lqlq1963@163.com
Abstract:Objective  The aim of this study was to investigate the association of the CYP19A1 rs7176005 single nucleotide polymorphism (SNP) with breast cancer risk and with clinicopathologic features of tumors.Methods  This study was conducted by including 138 patients with breast cancer (cancer group), those who diagnosed as primary breast cancer after operation by pathology. There were 293 cases in the group of benign breast disease which was presented as a solid mass by the color ultrasound and pathologically diagnosed as "fibroadenoma or adenosis" (benign breast disease group), the cases were paired with breast cancer patients by age±5 in the same period, and there were 259 cases in the group of healthy control who received routine physical examination during the same period and were paired with breast cancer patients by age±5 without any detection of breast related diseases (healthy control group) at West China hospital between September 2012 and November 2016. The CYP19A1 rs7176005 SNP was detected by a direct sequencing method. Hardy-Weinberg test was used to analyze the genetic balance of the 3 groups. Chi square test was used to compare the distribution of rs7176005 genotypes between the 3 groups, and the differences of clinicopathological features in breast cancer patients carrying different genotypes.Results  The ages of the breast cancer cases, the benign breast disease group and the healthy control group were (44.69±8.09), (42.33±11.44) and (41.92±9.61) years old, respectively. Hardy-Weinberg equilibrium test identified that the composition ratios of alleles C and T in breast cancer group, benign breast disease group and healthy group were not statistically significant (χ2 values were 0.83, 0.34 and 0.04, respectively, P values were 0.363, 0.561, and 0.852, respectively). All the three groups met the genetic balance, had consistency and could represent the population. Among the 138 cases of breast cancer, the CYP19A1 rs7176005 SNP was significantly associated with the diameter of the tumor (P=0.031). The majority of tumor size was <2 cm in patients who carrying TT and CT genotypes, and the proportion was 75% (12/16) and 58% (40/69), respectively. While those patients with TT genotype were mainly >2 cm and ≤5 cm, and the proportion was 51% (27/53). The distribution of TNM stage among patients with different genotypes was also statistically significant (χ2=11.19, P=0.025). The most common stage was Ⅱ in Patients who carrying CC and CT genotypes, and the proportion was 45.3% (24/53) and 52.2% (36/69), respectively. While those patients with TT genotype was mainly in stage Ⅰ and the proportion was 56.3% (9/16).Conclusion  Though the CYP19A1 rs7176005 SNP is not associated with breast cancer development, breast cancer patients with the C allele exhibit a high tumor growth rate and large diameters.
Key words :Polymorphism, single nucleotide;Breast neoplasms;Pathology;CYP19A1
全文

乳腺癌在我国女性恶性肿瘤中发病人数占首位,死亡人数居第六位[1]。乳腺癌是激素依赖性肿瘤,内源性雌激素的长期暴露会增加乳腺癌的发病危险[2,3]。然而,即使在相似的雌激素暴露下,也只有部分人发病,说明个体对雌激素的易感性存在差异,且这些差异主要源自乳腺癌的遗传倾向[4,5],但相关研究发现90%以上乳腺癌的发生与家族遗传无关[6,7]。这提示人群中可能存在大量与乳腺癌发生有关的低外显基因,这些基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)可能引起体内雌激素水平的变化或者使个体对雌激素的易感性不同,从而导致乳腺癌发病风险增加[8,9]
        CYP19A1基因位于染色体15q21.1上,其编码的细胞色素P450芳香化酶是雌激素合成的一个功能酶,因而在乳腺癌的发病和进展中的作用不容忽视[10,11]。CYP19A1基因的rs7176005多态位点位于该基因的启动子区,其碱基C/T的多态性,有可能改变P450芳香化酶活性改变从而导致个体对乳腺癌的易感性产生差异。因此,本研究应用前瞻性病例-对照研究的方法,通过TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术对rs7176005单核苷酸位点进行检测,并与乳腺癌分期以及分子分型相结合,探讨该多态位点在中国人群中的分布及是否可以作为乳腺癌的低外显性易感基因检测位点,同时分析该基因多态位点与乳腺癌临床病理特征的相关性,为SNP检测在乳腺癌早期诊断和预后中的应用提供实验依据。

对象与方法  

1.对象:  研究对象来自四川大学华西医院2012年9月至2016年11月乳腺科患者或者体检人员,并将其分为乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组和对照组。(1)乳腺癌病例组:138例,全部患者均经组织病理证实并拥有完整的免疫组织化学诊断结果,结果包括,雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)及单克隆抗体Ki-67鉴定抗原(antigen identified by monoclonal antibody Ki-67,Ki-67)。同时,按照美国癌症联合委员会(American Joint Committee in Cancer,AJCC)第7版分期手册[12],对其进行临床分期,其中Ⅰ期为40例,Ⅱ期为67例,Ⅲ期为31例。纳入标准:术后常规石蜡切片确诊为原发性乳腺癌患者;与组内患者无血缘关系。(2)乳腺良性疾病组:共纳入293例,纳入标准:同时期门诊彩超提示为乳腺实性包块,经穿刺诊断为"纤维腺瘤或者腺病"的患者;按年龄±5岁与乳腺癌病例组配对。(3)对照组:共纳入259名,纳入标准:华西医院同期门诊体检的健康女性,未发现乳腺相关疾病;按年龄±5岁与乳腺癌病例组配对。本研究通过了四川大学华西医院生物医学伦理委员会审核(批号:186),所有研究对象均签署了知情同意书。

2.乳腺癌分子分型判定标准:  按照2013年St Galllen共识进行分子分型[13]。其中免疫组化技术检测HER-2(3+)判为HER-2基因扩增阳性,HER-2(0或者1+)判为HER-2基因扩增阴性,HER-2(2+)患者再行荧光原位杂交技术检测HER-2基因是否有扩增。

3.CYP19A1基因rs7176005多态位点基因型检测:  使用DNA采样试剂盒和核酸采样试剂盒(中国上海浦美生物医药科技有限公司)采集研究对象的口腔黏膜上皮细胞,然后用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(中国康为世纪公司)抽提患者基因组DNA,置于-20 ℃冰箱中备用。再采用ABI Prism7500型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)扩增CYP19A1基因启动子区序列,上游引物为:AAGAGTGTCTGATCCCACAGGTTGA;下游引物为:CAACACATAGCACAGTTCCTGATTT。反应体系为:25 μl,含50~100 ng基因组DNA,5×缓冲液5 μl,1.25 U HotStarTaq聚合酶,2 μl dNTPs,上下游引物各0.25 μl,加双蒸水至25 μl。PCR反应条件为:94 ℃预变性10 min,95 ℃变性30 s,55~65 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共30~40循环后,72 ℃最终延伸5 min。最后,PCR产物应用Big Dye Terminator试剂盒在ABI 3730测序仪(美国应用生物系统公司)进行DNA直接测序,检测启动子区rs7176005位点碱基的多态性。

4.统计学分析:  采用SPSS 18.0软件进行数据整理和统计学分析。研究对象的年龄符合正态分布,采用±s表示。首先进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,以了解乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组以及对照组是否符合遗传平衡,其基因是否具有恒定性;然后采用χ2检验进行对照组、乳腺良性疾病组以及乳腺癌病例组CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性基因型分布的两两比较;最后采用χ2检验比较不同临床病例特征乳腺癌病例CYP19A1基因rs7176005位点基因型分布差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.基本情况:  乳腺癌病例组、乳腺癌良性疾病组、对照组对象分别为138、293和259例,年龄分别为(44.69±8.09)、(42.33±11.44)和(41.92±9.61)岁。

2.CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性分布:  CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性C/T各基因型通过DNA直接测序鉴定,结果显示,在该位点基因型共分3种:野生型(CC)、杂合型(CT)以及纯和突变型(TT)。3组研究对象在CYP19A1基因rs7176005位点均以野生型(CC)和杂合型(CT)基因型为主,纯和突变(TT)基因型在各组中均仅占10%左右,但3组基因型的频率分布的差异无统计学意义(P=0.471)。经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,3组人群P值均>0.05,即乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组以及对照组均符合遗传平衡,具有衡定性及群体代表性。详见表1

表1乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组和对照组对象等位基因分布及Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验

3.研究对象CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性情况:  对照组、乳腺良性疾病组以及乳腺癌组病例CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性基因型分布两两比较均无统计学差异,以CC基因型为参照,CT或TT基因型没有显著性地提高乳腺良性疾病或者乳腺癌的发病危险,在显性模型分析中,也没有发现(CT+TT)基因型有增加乳腺良性疾病或者乳腺癌的发病风险。见表2

表2乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组和对照组对象基因型分布

4.乳腺癌病例CYP19A1基因rs7176005多态性与病理特征的关系:  在138例乳腺癌病例中,CYP19A1基因rs7176005位点不同基因型的患者肿瘤组织大小差异有统计学意义(P=0.031),其中,携带TT和CT基因型的患者肿瘤组织大小以≤2 cm为主,比例分别为12/16和58%(40例),而携带TT基因型者以>2 cm且≤5 cm为主,比例为51%(27例);不同基因型患者间临床分期的分布差异有统计学意义(P=0.025),携带CC和CT基因型者以Ⅱ期为主,比例分别为45.3%(24例)和52.2%(36例),而携带TT基因型者以Ⅰ期为主,比例为9/16;不同基因型患者间Ki-67阳性率的差异有统计学意义(P=0.003),携带CC、CT和TT基因型者阳性率分别为84.9%(45例)、76.8%(53例)和7/15。详见表3

表3不同临床病理特征乳腺癌病例CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性比较

讨论  目前关于CYP19A1基因单核苷酸多态性与乳腺癌发病风险的研究报道较少,也仅局限在欧美人群[14,15]。Haiman等[14]研究了关于CYP19A1基因的大部分多态位点,发现在欧美绝经后人群中rs749292、rs727479、rs6493494、rs2414096、rs10046、rs700519和rs28757184等多态位点的基因型分布均与乳腺癌发病风险无明显关联。但是Ramalhinho等[15]的研究却发现CYP19A1第39密码子T/C突变与乳腺癌发病风险有关,TT基因型乳腺癌发病风险最高。因此,不同的多态位点基因型与乳腺癌发病的关系可能不同,而目前尚未见CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态位点与乳腺癌发病风险的研究报道,且单核苷酸多态性在东西方人群间也存在着明显差异,因此研究CYP19A1基因rs7176005单核苷酸多态性与中国人群乳腺癌发病状况的关系,有重大意义。
        在本研究中,乳腺癌病例组、乳腺良性疾病组以及对照组均符合遗传平衡,具有恒定性,证实本研究入组病例具有群体代表性,进一步的分析发现,该位点的多态性基因型分布在各组研究人群之间差异并无统计学意义。提示该位点多态性可能为无义突变,rs7176005尚不足以作为低外显性的乳腺癌易感基因位点。
        然而分析该多态位点与乳腺癌相关临床病理学特征的关系时,发现rs7176005位点基因型分布与肿瘤组织大小、肿瘤的TNM分期和Ki-67状态相关,其中含T等位基因的个体Ki-67阳性率较低,肿瘤较小,TNM分期也较低,尤其是TT基因型表现明显。推测其可能的机制是:野生型的等位基因(C)提高了芳香化酶的活性,使体内雌激素水平升高,然而增高了的雌激素水平尚不足以促进正常乳腺上皮细胞向癌细胞的转化,因此并未明显增加乳腺癌的患病风险,却明显地促进了激素受体阳性的癌细胞增殖生长,导致病例Ki-67阳性率较高,入院时包块大小也更大,从而TNM分期也较高。该理论是基于Haiman等[14]采用χ2检验的研究,发现在绝经后患者CYP19A1基因rs749292以及rs727479多态位点基因型与患者血清雌激素水平有明显关系;然而Watanabe等[16]的研究却发现rs700519单核苷酸多态性没有显著改变芳香化酶的效能,因而没有增加患者的患癌风险。由此可以看出不同的位点多态性对个体雌激素水平的影响有可能不同,所以下一步应重点研究CYP19A1基因rs7176005位点基因型分布与芳香化酶活性及雌激素水平的关系,探寻C等位基因导致肿瘤生长速度加快的具体机制。但是不管怎样,本研究中发现rs7176005位点含有C等位基因的人群,因为肿瘤可能生长迅速,建议缩短常规体检时间,从而降低间期癌发病率。
        此外,还有研究显示CYP19A1某些多态位点等位基因分布与雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)有关,并发现某些基因型与内分泌治疗效果有关,尤其是绝经后的妇女表现明显[17]。然而在本研究中却并未发现该基因位点多态性与ER、PR表达的关系。
        综上所述,CYP19A1基因rs7176005位点的多态性虽可能会对芳香化酶的合成功能以及内源性雌激素水平产生一定的影响,然而此影响对乳腺癌发病风险的影响非常有限,故不建议作为乳腺癌风险基因筛查的指标。但是含C等位基因的人群有肿瘤细胞快速增殖的可能,故建议缩短这类人群常规体检时间。本研究样本量尚不算大,rs7176005多态位点的作用尚需要多中心的大样本的临床遗传学研究进行确定,其机制探讨则有待于进一步基础研究分析该多态位点基因型对芳香化酶活性以及血雌二醇水平的影响。

参考文献
[1]ChenW, ZhengR, BaadePD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66: 115-132. DOI: 10.3322/caac.21338.
[2]LecarpentierJ, NoguèsC, Mouret-FourmeE, et al. Breast Cancer Risk Associated with Estrogen Exposure and Truncating Mutation Location in BRCA1/2 Carriers[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2015,24(4):698-707. DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-14-0884.
[3]SantenRJ, YueW, WangJP. Estrogen metabolites and breast cancer[J]. Steroids, 2015,99(Pt A):61-66. DOI: 10.1016/j.steroids.2014.08.003.
[4]BlazerKR, SlavinT, WeitzelJN. Increased Reach of Genetic Cancer Risk Assessment as a Tool for Precision Management of Hereditary Breast Cancer[J]. JAMA Oncol, 2016,2(6):723-724. DOI: 10.1001/jamaoncol.2015.5975.
[5]DohertyJ, BonadiesDC, MatloffET. Testing for Hereditary Breast Cancer: Panel or Targeted Testing? Experience from a Clinical Cancer Genetics Practice[J]. J Genet Couns, 2015,24(4):683-687. DOI: 10.1007/s10897-014-9796-2.
[6]DesmondA, KurianAW, GabreeM, et al. Clinical Actionability of Multigene Panel Testing for Hereditary Breast and Ovarian Cancer Risk Assessment[J]. JAMA Oncol, 2015,1(7):943-951. DOI: 10.1001/jamaoncol.2015.2690.
[7]JacksonSA, DavisAA, LiJ, et al. Characteristics of individuals with breast cancer rearrangements in BRCA1 and BRCA2[J]. Cancer, 2014,120(10):1557-1564. DOI: 10.1002/cncr.28577.
[8]SunMY, DuHY, ZhuAN, et al. Genetic polymorphisms in estrogen-related genes and the risk of breast cancer among Han Chinese women[J]. Int J Mol Sci, 2015,16(2):4121-4135. DOI: 10.3390/ijms16024121.
[9]袁雪莲,徐珠屏,刘春容,等.持续肥胖、人类瘦素及瘦素受体基因多态性与不同分子亚型乳腺癌的关系研究[J].中华预防医学杂志,2017,51(6):533-538. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.06.015.
[10]Leyland-JonesB, GrayKP, AbramovitzM, et al. CYP19A1 polymorphisms and clinical outcomes in postmenopausal women with hormone receptor-positive breast cancer in the BIG 1-98 trial[J]. Breast Cancer Res Treat, 2015,151(2):373-384. DOI: 10.1007/s10549-015-3378-3.
[11]MazzucaF, BotticelliA, MazzottiE, et al. CYP19A1 GeneticPolymorphisms rs4646 and Osteoporosis in Patients Treated with Aromatase Inhibitor-Based Adjuvant Therapy[J]. Eurasian J Med, 2016,48(1):10-14. DOI: 10.5152/eurasianjmed.2015.008.
[12]EdgeSB, ByrdDR, ComptonCC,et al. AJCC cancer staging manual[M]. 7th ed. NewYork: Springer,2010.
[13]GoldhirschA, WinerEP, CoatesAS, et al. Personalizing the treatment of women with early breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2013[J]. Ann Oncol, 2013,24(9):2206-2223. DOI: 10.1093/annonc/mdt303.
[14]HaimanCA, DossusL, SetiawanVW, et al. Genetic variation at the CYP19A1 locus predicts circulating estrogen levels but not breast cancer risk in postmenopausal women[J]. Cancer Res, 2007,67(5):1893-1897. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-06-4123.
[15]RamalhinhoAC, Fonseca-MoutinhoJA, BreitenfeldGLA. Positive association of polymorphisms in estrogen biosynthesis gene, CYP19A1, and metabolism, GST, in breast cancer susceptibility[J]. DNA Cell Biol, 2012,31(6):1100-1106. DOI: 10.1089/dna.2011.1538.
[16]WatanabeJ, HaradaN, SuemasuK, et al. Arginine-cysteine polymorphism at codon 264 of the human CYP19 gene does not affect aromatase activity[J]. Pharmacogenetics, 1997,7(5):419-424.
[17]KhvostovaEP, PustylnyakVO, GulyaevaLF. Genetic polymorphism of estrogen metabolizing enzymes in Siberian women with breast cancer[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2012,16(3):167-173. DOI: 10.1089/gtmb.2011.0131.