中华预防医学杂志    2018年09期 氯化消毒对细菌抗生素抗性质粒及其所携抗性基因的转移及破坏机制研究    PDF     文章点击量:106    
中华预防医学杂志2018年09期
中华医学会主办。
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杨忠委 姜翰集 谌志强 杨栋 邱志刚 刘璐 尹静 王华然 李君文 金敏
YangZhongwei,JiangHanji,ChenZhiqiang,YangDong,QiuZhigang,LiuLu,YinJing,WangHuaran,LiJunwen,JinMin
氯化消毒对细菌抗生素抗性质粒及其所携抗性基因的转移及破坏机制研究
Study on the transfer mechanism and destructive law of the bacterial antibiotic resistance genes disinfected by chlorination
中华预防医学杂志, 2018,52(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.09.005

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投稿日期: 2018-03-18
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氯化消毒对细菌抗生素抗性质粒及其所携抗性基因的转移及破坏机制研究
杨忠委 姜翰集 谌志强 杨栋 邱志刚 刘璐 尹静 王华然 李君文 金敏     
杨忠委 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
姜翰集 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
谌志强 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
杨栋 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
邱志刚 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
刘璐 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
尹静 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
王华然 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
李君文 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
金敏 300050 天津,军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
摘要: 目的  研究氯化消毒在不同环境条件下对抗生素抗性细菌大肠埃希菌(E. coli)HB101(pUC19质粒)的灭活规律以及对其抗生素抗性基因的转移和破坏机制。方法  将E. coli菌株与0.5、0.75、1.00、0.55 mg/L次氯酸钠作用后,分别在0.25、1、2、5、10、20、30 min的处理时间进行余氯测定、菌落计数,并采用消毒一级动力学模型和灭活动力学EFH模型进行拟合,获得E. coli的灭活曲线,同时,采用PCR技术进行抗生素抗性质粒pUC19质粒及其氨苄青霉素抗性基因(ampr)的检测,利用细菌转化试验评价抗生素抗性质粒的功能,计算达到不同的细胞杀灭对数值时的Ct值(t时刻的余氯浓度)。结果  消毒温度和pH值对水中E. coli的杀灭、pUC19质粒和ampr的破坏具有显著影响,当消毒温度为4、20、36 ℃时,细胞消灭对数值达到5时所需Ct值分别为11.92、10.28、7.67 min·mg/L。同时,当消毒pH分别为6.0、7.2、8.0,氯浓度分别为0.75、0.70、0.55 mg/L时,细胞消灭对数值达到5时所需Ct值分别为6.68、10.28、15.73 min·mg/L。pH 7.2且消毒温度为4、20、36 ℃,氯浓度分别为9、5、3 mg/L时,为完全破坏细胞外游离抗生素抗性质粒的转化功能,消毒所需Ct值分别为36.11、34.17、16.09 min·mg/L。次氯酸钠消毒会导致游离ampr基因甚至具有转化功能的完整质粒pUC19质粒释放,并污染水体,只有当Ct值达到903.03 min·mg/L之后,完整的ampr基因才能被消除,远远超过细菌致死Ct值。结论  次氯酸钠消毒过程中,抗生素抗性细菌E. coli全部被破坏,但其携带抗生素抗性的DNA片段(质粒和基因)仍可能保持完整性且具有转化功能。
关键词 :消毒;水;抗生素类;抗生素抗性基因
Study on the transfer mechanism and destructive law of the bacterial antibiotic resistance genes disinfected by chlorination
YangZhongwei,JiangHanji,ChenZhiqiang,YangDong,QiuZhigang,LiuLu,YinJing,WangHuaran,LiJunwen,JinMin     
Institute of Environmental and Operational Medicine, Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control for Environment & Food Safety, Tianjin 300050, China
Corresponding author: Jin Min, Email: jinminzh@126.com
Abstract:Objective  To study the response of Escherichia coli (E. coli) HB101 (plasmid pUC19) and its carried antibiotic resistance genes to the process of cholorination under different environmental conditions.Methods  The E. coli strain was reacted with sodium hypochlorite at the concentration of 0.5, 0.75, 1.00, and 0.55 mg/L, then the residual chlorine and the colonies were detected at the 0.25, 1, 2, 5, 10, 20, and 30 min of the reaction, respectively. The first order disinfection kinetic model and EFH model were used to evaluate the inactivation effect of E. coli (plasmid pUC19) treated by sodium hypochlorite, while the plasmid pUC19 and antibiotic resistance gene ampr were detected by PCR method. Besides, the logarithm of Ct (residual chlorine in t) under different concentration were calculated.Results  The temperature and pH value played important roles on the inactivation of E. coli and elimination of plasmid pUC19 and ampr under the function of sodium hypochlorite. The Ct value needed for 5-log of E.coli HB101(pUC19) inactivation at 4, 20, 36 ℃ was 11.92, 10.28, 7.67, respectively, and when the pH was in 6.0, 7.0, 8.0, with chloride concentration were 0.75, 0.70, 0.55 mg/L, the Ct value needed for reached to 6.68, 10.28, 15.73 min·mg/L. At pH 7.2 condition, when the temperature was 4, 20, 36 ℃, and chloride concentration were 9, 5, 3 mg/L.The required Ct values to completely destroy the transformation function of free antibiotic resistant plasmids were 36.11, 34.17,16.09 min·mg/L. Sodium hypochlorite disinfection can release free ampr gene and even the transformed plasmid pUC19, and pollute the water body. Only when the Ct value reached 903.03 min·mg/L, the complete ampr gene can be destroyed which was far more exceed the bacterial lethal Ct value.Conclusion  Even if all the antibiotic resistant bacteria were inactivated, the antibiotic resistant plasmids or genes might still maintain complete with the transformable function, which may result in new potential risks of waterborne diseases.
Key words :Disinfection;Water;Antibiotics;Antibiotic resistance genes
全文

Pruden等[1]在2006年首次提出抗生素抗性基因作为一种新型污染物,在近十年的研究中,人们发现抗生素抗性基因污染广泛存在于河流、水源水、再生水、饮用水等不同水体中,而且在一定条件下会发生水平基因转移[2,3,4,5,6,7,8,9]。因此,抗生素抗性基因在环境中的传播已经成为世界上新近出现的最大环境问题之一。同时,寻找其产生原因及其传播机制也是近几年的研究热点。目前,抗生素的滥用、含有杀菌剂产品的广泛使用均被认为是环境抗生素抗性菌污染和传播的原因之一[10,11,12],同时,Liu等[13]发现,污水处理厂出水经过消毒处理后,胞内抗生素抗性基因和胞外抗生素抗性基因的浓度均较消毒前显著提升。次氯酸钠因杀菌能力广谱、安全、高效而被广泛应用于饮水消毒中[14]。因此,研究其在消毒过程中对抗生素抗性菌及抗生素抗性基因的影响具有重要的意义。本研究对氯化消毒在不同环境条件下对抗生素抗性菌的灭活规律以及对其抗生素抗性基因的影响进行了探讨,为进一步揭示导致抗生素抗性基因传播和扩散的规律提供依据。

材料与方法  

1.仪器设备及试剂:  PCR仪(型号Thermal cycler,美国Applied Biosystem公司),电泳仪(DYY-6C型,北京六一生物科技有限公司),凝胶成像系统(Image Quant 350,美国GE公司),胰酪胨大豆琼脂(TSA培养基,美国BD公司),质粒提取试剂盒(美国BIOMIGA公司),DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)。

2.实验菌株及菌悬液制备:  本实验所用的菌株为E. coli HB101,其所携带的质粒pUC19质粒具有氨苄青霉素抗性。将大肠埃希菌(Escherichia coliE. coli)HB101(pUC19质粒)接种于含有60 μg/ml氨苄青霉素的肉汤中,于37 ℃,150 rpm下摇床培养12 h。培养后的菌液5 000×g离心3 min后,弃上清,于细菌沉淀中加入PBS(pH 7.2),重悬混匀后继续5 000×g离心3 min,重复处理细菌3次后,加入10 ml PBS,测定在600 nm波长处的吸光度值(A600)并调整细菌浓度为108 CFU/ml,备用。

3.氯化消毒及菌落计数:  于250 ml棕色试剂瓶中加入100 ml PBS(pH 7.2)和1 ml上述制备的菌悬液,混匀后(初始细菌浓度N0)加入0.5、0.75、1.00、0.55 mg/L浓度次氯酸钠,分别在接触时间0.25、1、2、5、10、20、30 min时,吸取3 ml样品用于余氯含量测定,7 ml样品加入硫代硫酸钠溶液(50 mg/L)中终止消毒反应,用于细菌计数。每种实验条件下均作三次重复[15]。取各时刻消毒后的样品进行稀释后,利用具有细菌损伤修复性的TSYA培养基[含胰酪胨大豆肉汤(trypticase soy broth,TSB)+0.3%酵母浸粉+1.5%营养琼脂]进行活细菌总数的计数,37 ℃培养24 h,每个样品作3次平行测定。

4.抗生素抗性质粒及其抗生素抗性基因的检测:  将不同时刻消毒后的样品经微孔滤膜(Ф 0.22 μm)过滤后,收集滤液。利用PCR技术检测抗生素抗性质粒pUC19质粒及其氨苄青霉素抗性基因(AmpR ampr ampicillinampr)。pUC19质粒全长扩增引物:pUC19质粒F: 5′-CTGTTAATGCATACCTCGTTGAAGTA-3′,pUC19质粒R: 5′-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC-3′,目的片断长度为2 245 bp;ampr全序列扩增引物:ampF:5′-AGTTACCAATGCTTAATCAGTGAG-3′,ampR: 5′-AGTATGAGTATTCAACATTTCCGT-3′,目的片断长度为880 bp。PCR反应体系为50 μl,反应条件:95 ℃,5 min;95 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、1 min,30个循环;72 ℃,5 min。随后,将PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳实验,分别检测pUC19质粒全长和ampr基因的完整性。

5.抗生素抗性质粒转化功能的验证:  取50 μl制备的感受态E.coli DH5α于4 ℃水浴融化后,加入过滤后的各时刻消毒样品40 μl,并混合均匀。4 ℃水浴30 min,42 ℃热激45 s,轻轻地转移至冰水中,作用2 min,向离心管中加入500 μl SOB培养基,充分混匀,于37 ℃摇床震荡1 h;将反应样品涂布于氨苄青霉素抗性平板,置于37 ℃培养箱培养24 h。挑取平板上的典型菌落,验证阳性转化子[16]。同时以蒸馏水或提纯的质粒替代样品作为阴性或为阳性对照。

6.统计学分析:  采用经典的消毒一级动力学模型[16],即公式Ct=C0e-kt,分析消毒过程中次氯酸钠衰减情况,式中,Ctt时刻的余氯浓度,C0为氯的初始浓度(mg/L),k'为一级动力学衰减常数(min-1),t为消毒时间(min),用Excel 2007进行余氯衰减的拟合得出k'值。采用灭活动力学EFH模型(Efficiency factor Hom)[17]依次对消毒过程中对抗生素抗性菌的消毒情况进行检测并进行拟合,拟合公式:lnNt/N0=-kC0×n×t×m×[(1-e)/(n×k×t/m)]×m,式中,k为灭活速率常数,n为稀释系数,m为Hom指数,Nt/N0为细菌的灭活率(t时刻存活的细菌浓度除以初始细菌总浓度)。采用Excel 2007和OrigonPro 8.0软件进行EFH模型的拟合,并计算细菌在两种培养基下,计算达到不同的细胞杀灭对数值(2~5)条件下的Ct值。根据DNA检测结果,计算细菌质粒全长和抗生素抗性基因损伤的Ct值。

结果  

1.抗生素抗性菌E.coli(pUC19质粒)在次氯酸钠作用下的灭活规律:  细菌的杀灭对数值与EFH模型均有较好的拟合结果,R2值均大于0.97,相关参数见表1。计算在不同消毒条件下E.coli(pUC19质粒)致死率的Ct值见表2。由表可知,在相同消毒条件下,随着杀灭细菌数量的增多,即log值的增加,所需次氯酸钠的Ct值不断升高。当消毒温度为20 ℃、水样pH值为7.2时,达到2-lg杀灭值所需Ct值为1.24 min·mg/L,而达到5-lg杀灭值所需Ct值为10.28 min·mg/L。

表1不同条件下次氯酸钠对大肠埃希菌(pUC19质粒)作用的EFH模型拟合参数
表2不同条件下次氯酸钠灭活大肠埃希菌(pUC19质粒)达到不同杀灭对数值所需的Ct
同时,温度和pH值等消毒条件对细菌的杀灭效果具有显著性影响。图1A表明,当消毒温度为4、20、36 ℃时,达到5-lg细菌杀灭值所需Ct值分别为11.92、10.28、7.67 min· mg/L。因此,在测试温度范围内,随着温度的升高,获得相同细菌杀灭对数值所需Ct值逐渐降低。同时,当消毒pH分别为6.0、7.2、8.0时,达到5-lg杀灭值所需Ct值分别为6.68、10.28、15.73 min·mg/L,在测试pH值范围内,随着pH值的升高,获得相同杀灭对数值所需Ct值逐渐升高(图1B)。因此,在一定范围内,升高消毒温度和降低pH值有助于提高次氯酸钠对细菌的消毒效果。
图1不同温度和pH下次氯酸钠对大肠埃希菌(pUC19质粒)的致死曲线 图A:不同温度下次氯酸钠对大肠埃希菌(pUC19质粒)的致死曲线;图B:不同pH条件下次氯酸钠对大肠埃希菌(pUC19质粒)的致死曲线

2.E.coli(pUC19质粒)所携质粒抗生素抗性基因抗性效果:  表3结果表明,即使细菌杀灭率达到100%,水样中仍检测出完整的抗生素抗性质粒且这些质粒仍具有转化功能,只有当消毒剂Ct值达到34.17 min·mg/L以后,样品中不能检出pUC19质粒也无转化现象发生。对于ampr基因,只有当Ct值达到903.03 min·mg/L之后,完整的ampr基因才检测不出(表4)。同时,消毒温度和pH对抗生素抗性质粒和抗生素抗性基因的破坏效果也具有影响:在一定范围内,升高消毒温度和降低pH值同样有助于提高次氯酸钠对抗生素抗性质粒和抗生素抗性基因的破坏。表3表明,当消毒温度为4、20、36 ℃时(pH 7.2),为完全破坏细胞外游离抗生素抗性质粒的转化功能,消毒所需Ct值分别为36.11、34.17、16.09 min·mg/L;而由表4可看出,同样条件下,破坏ampr基因则需要3675.24,903.03,1 516.14 min·mg/L。因此,在测试温度范围内,随着温度的升高,破坏抗生素抗性质粒和抗生素抗性基因所需Ct值逐渐降低。同时,当水样pH分别为6.0、7.2、8.0时(20 ℃),破坏细胞外游离抗生素抗性质粒pUC19质粒转化功能的Ct值分别为7.91、34.17、75.57 min·mg/L,而破坏ampr则需要373.33、903.03、4 809.2 min·mg/L,因此,在测试pH值范围内,随着pH值的升高,破坏pUC19质粒转化能力及其ampr所需Ct值逐渐升高(表4)。以上结果说明,细菌的消毒,会导致大量游离抗生素抗性基因产生,甚至具有转化功能的完整质粒的释放,并污染水体,而这些污染抗生素抗性基因则需要超高剂量的消毒剂才能破坏,远远超过细菌致死Ct值。

表3不同条件下次氯酸钠消毒对大肠埃希菌胞外pUC19质粒长度及其转化能力的影响
表4不同条件下次氯酸钠消毒对氨苄青霉素抗性基因的影响

讨论  氯化消毒的机制尚无定论,但氯化消毒致细菌死亡并不是对细菌DNA的损伤,即使细菌已被灭活,细菌DNA的损伤也并不明显,只有在消毒剂量远高于正常值时才出现DNA的损伤[17]。质粒携带的耐药性已经成为一个公众性关注的问题,因其耐药基因的扩散会损害处于同一生态系统的有益菌,从而对微环境造成极大的破坏[18]。因此,研究耐药菌及其耐药基因在水处理过程,尤其消毒处理工艺中的传播机制具有重要的意义。
        本研究借助携带具有ampr的质粒pUC19质粒的菌株E. coli HB101,研究了氯化消毒在不同环境条件下对抗生素抗性细菌E. coli HB101(pUC19质粒)的灭活规律以及对其抗生素抗性基因的破坏规律。研究发现,温度和pH值等环境条件,对氯化消毒对细菌的杀灭效果具有显著影响,同时,对抗生素抗性质粒和抗生素抗性基因的破坏效果也具有显著影响。在本研究的温度和pH范围内,升高消毒温度和降低pH值对氯化消毒对细菌的杀灭及对抗生素抗性质粒和抗性基因的破坏均有提高。在次氯酸钠消毒过程中,即使抗生素抗性细菌E. coli全部死亡,但其携带抗生素抗性的DNA片段(质粒和基因)仍可能保持完整性,且抗生素抗性质粒仍可能具有转化功能,而破坏这些抗生素抗性基因需要超高剂量的次氯酸钠才能实现,远远超过细菌致死Ct值。
        本研究发现,次氯酸钠对细菌的消毒过程中,因细菌灭亡导致大量游离抗生素抗性基因甚至具有转化功能的完整质粒释放到水体中,进而造成水体污染。本研究表明常规饮水氯消毒不仅不能完全破坏细菌携带的抗生素抗性基因,甚至对抗生素抗性基因的转移与扩散有促进作用,这与消毒保证饮水安全的结果产生矛盾,由此带来的新的饮水安全问题,对目前消毒技术的应用提出了新的挑战。

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