中华预防医学杂志    2018年09期 上海市热带念珠菌临床分离株耐药性及多位点序列分型研究    PDF     文章点击量:96    
中华预防医学杂志2018年09期
中华医学会主办。
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陈智瑾 曹宇硕 宰淑蓓 胡芸文 朱召芹
ChenZhijin,CaoYushuo,ZaiShubei,HuYunwen,ZhuZhaoqin
上海市热带念珠菌临床分离株耐药性及多位点序列分型研究
Investigation of drug resistance and multilocus sequence typing for differentiation of strains of Candida tropicalis of Shanghai
中华预防医学杂志, 2018,52(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.09.012

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投稿日期: 2017-11-07
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上海市热带念珠菌临床分离株耐药性及多位点序列分型研究
陈智瑾 曹宇硕 宰淑蓓 胡芸文 朱召芹     
陈智瑾 201508 上海市公共卫生临床中心医学检验科
曹宇硕 201508 上海市公共卫生临床中心医学检验科
宰淑蓓 201508 上海市公共卫生临床中心医学检验科
胡芸文 201508 上海市公共卫生临床中心医学检验科
朱召芹 201508 上海市公共卫生临床中心医学检验科
摘要: 目的  分析上海市感染性疾病患者的热带念珠菌临床分离株耐药性,并对其进行分子特征研究。方法  于2012—2015年,从上海市公共卫生临床中心87例感染性疾病患者的真菌培养标本中分离热带念珠菌,共95株;同时,收集患者的临床基本资料。采用ATB FUNGUS 3药物敏感性检测板条分析菌株对抗真菌药物的耐药性,采用多位点序列分型法(MLST)对其进行分型,同时应用MEGA 5.2软件中UPGMA方法对95株热带念珠菌进行同源性分析。结果  95株热带念球菌分别来源于结核病患者(31株)、艾滋病患者(21株)、肝病患者(19株)和罕见原因感染或发热患者(24株);对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的耐药率分别为:2.1%(2株)、0、26.3%(25株)、26.3%(25株)和26.3%(25株),其中,唑类耐药株患者分别来源于罕见原因感染或发热患者(14株)、艾滋病患者(8株)和结核病患者(3株)。MLST分型分析显示,产生72个序列型(ST型),其中70种为新型别;进化树分析显示,95株临床株分布为三大簇,唑类耐药株中有24株(96.0%)分布于同一簇。结论  分离的热带念珠菌主要对唑类药物耐药,MLST分型显示与其遗传背景密切相关。
关键词 :念珠菌,热带;基因型;真菌;耐药性;多位点序列分型法
Investigation of drug resistance and multilocus sequence typing for differentiation of strains of Candida tropicalis of Shanghai
ChenZhijin,CaoYushuo,ZaiShubei,HuYunwen,ZhuZhaoqin     
Department of Clinical Laboratory, Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China
Corresponding author: Zhu Zhaoqin, Email: zhuzhaoqin@shaphc.org
Abstract:Objective  To analyze the drug resistance of clinical isolates of Candida tropicalis in patients with infectious diseases, and preliminarily study their molecular characteristics.Methods  95 strains of Candida tropicalis were isolated from the fungal culture specimens of 87 patients with infectious diseases in Shanghai Public Health Clinical Center from 2012 to 2015. Meanwhile, basic clinical data of patients were collected. The drug resistance of the strains to fungal drugs was analyzed by ATB FUNGUS 3 drug sensitivity test strips. All strains were classified by Multilocus sequence typing(MLST). Then, homology analysis was conducted by MEGA 5.2 software, and the evolutionary tree was mapped by using UPGMA method.Results  Patients distribution of strains was rendered as following: 31 strains from TB patients, 21 strains from HIV/AIDS patients, 19 strains from patients with liver disease, and 24 strains from rare cause infection or fever patients. The drug resistance rate to five antifungal drugs commonly used in clinical (amphotericin B, 5-fluorine cytosine, fluconazole, itraconazole, voriconazole) were 2.11% (2 strains), 0, 26.32% (25 strains), 26.32% (25 strains), and 26.32% (25 strains) respectively. Among the 25 azole-resistant strains: 14 strains were from rare cause infection or fever patients, 8 strains were from HIV/AIDS patients, and 3 strains were from tuberculosis patients. In MLST, 72 sequence types (ST types) were produced, 70 of which were new types. Evolutionary tree analysis showed that 95 strains of clinical strains distribute as three large clusters. 24 azole resistant strains (96.0%) were located in CLUSER Ⅰ.Conclusion  The isolated Candida tropicalis were mainly resistant to azole drugs. MLST typing indicates that they was closely related to their genetic background.
Key words :Candida tropicalis;Genotype;Blastocladiomycota;Drug resistance;Multilocus sequence typing
全文

住院患者罹患侵袭性念珠菌病的预后差,病死率高[1]。其中,感染性疾病的住院患者(如艾滋病患者、肝炎病患者、结核病患者、神经系统感染昏迷患者),由于其病程漫长、难以治愈,加上长期卧床和各种侵入性医疗操作以及抗感染用药,使其成为念珠菌感染的易感人群。尽管白色念珠菌依然是最主要的念珠菌病病原体,但近年来感染非白念珠菌者所占的比例呈明显上升趋势,其中以热带念珠菌最为常见[2]。较之白色念珠菌,热带念珠菌的耐药情况更普遍,治疗更困难,需要引起重视[3]。另外,由于热带念珠菌具有容易形成生物膜的特点[4],使其有较强的黏附性,导致院内消毒容易残留、患者反复感染,甚至出现院内播散,因此对菌株进行同源性分析,确证是否出现同一克隆菌株的院内传播具有非常重要的意义。本研究对感染性疾病患者临床标本中分离的95株热带念珠菌进行了耐药性分析,并采用多位点序列分型方法(multilocus sequence typing,MLST)对其进行分型研究。现将结果阐述如下。

材料与方法  

1.菌株来源:  于2012—2015年,分离上海市公共卫生临床中心87例感染性疾病患者的真菌培养标本,标本包括痰液、胃液、尿液、粪便、全血、胸腔积液、腹腔积液、分泌物、引流物、灌洗液、支刷物、导管和组织标本等,其中不含浅部感染标本(如皮肤标本),共得到95株热带念珠菌。本研究通过上海市公共卫生临床中心医学伦理委员会伦理审查;所有研究对象均签署了知情同意书。

2.主要仪器与试剂:  (1)仪器:ATB微生物鉴定系统(法国梅里埃公司)、Mastercycler nexus PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)、微量核酸蛋白检测仪(德国Eppendorf公司)和电泳成像系统(美国Bio-Rad公司)。(2)试剂:引物均由上海迈浦生物科技有限公司合成、PCR反应试剂盒(日本Takara公司)、ATB FUNGUS 3药物敏感性检测板条(法国梅里埃公司)和酵母基因组DNA提取试剂盒(DP307)[天根生化科技(北京)有限公司]。

3.抗真菌药物敏感性分析:  采用ATB FUNGUS 3药物敏感性检测板条,按说明书进行操作,其原理为微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。测试药物包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B和5-氟胞嘧啶。质量控制方法和结果判定依据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)关于酵母菌的液体培养基稀释法(全量法与微量法)《真菌药物敏感性试验方案M27-A3(2008年版)》[5]。质控菌株:克柔念珠菌(ATCC6258)、近平滑念珠菌(ATCC22019)。

4.基因组DNA的提取:  用酵母基因组DNA提取试剂盒(DP307)提取热带念珠菌基因组DNA,具体操作按说明书进行。用微量核酸检测仪检测提取DNA的纯度和质量,符合要求者置于-30 ℃冷冻保存,用于后续实验。

5.MLST分型检测:  根据热带念珠菌MLST数据库(http://pubmlst.org/ctropicalis/)标准参考方法[6],分别扩增热带念珠菌ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a等6个管家基因片段,引物序列见表1。50 μl PCR反应体系,包括:25 μl Premix rTaq (TAKARA)、20 μl dH2O、3 μl模板DNA、上下游引物各1 μl。扩增程序为:94 ℃预变性7 min; 94 ℃变性1 min,52 ℃退火1 min,74 ℃延伸1 min 5 s,共30个循环;74 ℃终延伸10 min。扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳证实为单一条带后,送上海迈浦生物科技有限公司测序,测序引物与扩增引物相同。将所测序列与热带念珠菌MLST数据库进行比对,鉴定出等位基因型(Allele type)与序列型(sequence type,ST)。

表1多位点序列分型法扩增管家基因引物序列及测序范围

6.系统进化树分析:  将每个菌株的6段管家基因序列片段连接为一整条,应用MEGA 5.2分析软件,采用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)对95株热带念珠菌进行同源性分型,并绘制进化树图,研究热带念珠菌菌株之间的相关性。

7.质量控制:  使用近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258进行药敏检测的质量控制,每批样本检测均进行质控,当且仅当两株标准菌株的MIC值都在质控范围时认为本次实验结果有效。

结果  

1.菌株基本情况:  95株热带念珠菌的标本来源分布为:痰液41株、尿液25株、粪便12株、咽拭子3株、胃液4株、生殖道分泌物1株、全血4株、穿刺液1株、脓1株、腹水1株、引流物2株;患者类型分布为:艾滋病患者21株、罕见原因感染或发热患者24株、肝炎病患者19株、结核病患者12株。

2.药物敏感性和耐药性:  95株临床分离株对5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的耐药率分别为2.11%(2株)、26.3%(25株)、26.3%(25株)和26.3%(25株),对两性霉素B均不耐药。其中,2株5-氟胞嘧啶耐药株(不同时期,分离自同一患者的同一类型标本)均来源于艾滋病患者;25株唑类药物耐药株来源于不明原因感染或发热患者(14株)、艾滋病患者(8株)和结核病患者(3株)。详见表2

表295株热带念珠菌对不同药物的敏感性

3.MLST分型分析:  ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1和ZWF1a管家基因片段序列与MLST数据库比对后得到等位基因数分别为5、9、3、11、11和7个。6个等位基因组合后得到72个ST型,除5株为已知ST412型,8株为已知ST544型外,其余82株共得到70个新的ST型(STnew1~STnew70),占总菌株数的73.7%(82株)。

4.系统进化树分析:  95株临床分离株聚成三大簇,25株唑类耐药株在进化树中呈集中分布,其中有24株分布于第一簇(平均遗传距离为0.008)中,且22株聚集于一个小分支上;有1株分布于第二簇,但处于距离第一簇接近的位置。2株5-氟胞嘧啶耐药株在进化树中分别分布于第一和第三簇。

讨论  根据中国侵袭性真菌耐药监测网监测以及最新的中国重症患者侵袭性念珠菌感染的多中心前瞻性观察研究结果[7,8,9],虽然白色念珠菌仍是我国侵袭性真菌感染最常见的病原菌,但热带念珠菌紧随其后,分离比率已达到16%以上。本研究纳入的95株热带念珠菌分离自临床怀疑真菌感染或定植的典型患者送检标本,其病原学特征具有代表性。耐药性分析发现,不同病房来源、不同标本来源、不同年龄患者来源菌株均有不同程度的耐药,其主要来源于不明原因感染或发热入院患者(非真菌感染而入院)和艾滋病患者,在患者的治疗和护理中应该引起重视[10]。虽然目前未有研究对热带念珠菌全国范围的耐药性进行总结,近年热带念珠菌对唑类不敏感率上升已经成为了广泛的现象,一些医院的非敏感率上升明显[4]。一项亚太地区2012—2014年涵盖13家监测中心的研究(未纳入中国地区数据)报道,热带念珠菌的非敏感率为24.2%[11],而本研究中热带念珠菌的非敏感率(26.3%)略高于此。目前研究临床用药对于导致念珠菌属耐药的影响并无明确定论,但已有研究表明不同来源的氟康唑非敏感热带念珠菌之间有基因相关性[12]。因此,从分子生物学角度对热带念珠菌的遗传背景进行调查,对了解该菌感染和耐药的来源具有十分重要的意义。
        MLST是目前分子分型经常使用的方法,并在流行病学的应用已经得到研究的支持,例如评估局部感染暴发、评价菌群结构等[13]。目前上海地区尚未有研究者将MLST专门用于热带念珠菌的分子流行病学研究。与相关研究结果相似[14],本研究中感染性疾病患者临床分离株基因分布呈多态性,未见明显优势株,95株热带念珠菌可分为72个ST型,MLST数据库中已有的412型和544型分别分离到5和8株,在医院感染控制的角度,这些菌株应该引起重视,建议通过补充分析方法(例如PFGE)确定是否为同一克隆株,防止院内感染的流行[15]。与Chou等[16]的研究结果相似,本研究聚类分析发现,95株临床分离株聚成三大簇,25株唑类耐药株中有24株分布于第一簇中,且大多数(22株)聚集于一个小分支上,证明这部分唑类耐药株亲缘关系十分接近;但有1株分布于第二簇,其遗传背景相对特殊。2株5氟胞嘧啶耐药株均来自于艾滋病患者,分型为不同型别,且在进化树中分别分布于第一簇和第三簇中,研究期间尚未在其他病区发现此类菌株,艾滋病患者作为一种特殊人群感染的分离株在遗传背景上十分多样,且存在反复感染不同菌株的现象,应该在预防感染和感染后控制中予以重视。综上,本研究中感染性疾病患者分离热带念珠菌基因多态性丰富,唑类药物的菌株在聚类分析中显示有一定的亲缘关系。

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