中华预防医学杂志    2018年10期 低剂量汞、铅和镉联合暴露致大鼠海马神经元细胞损伤的实验研究    PDF     文章点击量:74    
中华预防医学杂志2018年10期
中华医学会主办。
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李宗光 周繁坤 尹广明 高艳艳 蒋昕 刘思思 张圆圆 薄丹丹 谢杰 贾启越 冯建高 冯昶 范广勤
LiZongguang,ZhouFankun,YinGuangming,GaoYanyan,JiangXin,LiuSisi,ZhangYuanyuan,BoDandan,XieJie,JiaQiyue,FengJiangao,FengChang,FanGuangqin
低剂量汞、铅和镉联合暴露致大鼠海马神经元细胞损伤的实验研究
Cellular damage of low-dose combined exposure to mercury, lead and cadmium on hippocampal neurons in rats
中华预防医学杂志, 2018,52(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.10.003

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投稿日期: 2018-05-15
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低剂量汞、铅和镉联合暴露致大鼠海马神经元细胞损伤的实验研究
李宗光 周繁坤 尹广明 高艳艳 蒋昕 刘思思 张圆圆 薄丹丹 谢杰 贾启越 冯建高 冯昶 范广勤     
李宗光 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
周繁坤 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
尹广明 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
高艳艳 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
蒋昕 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
刘思思 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
张圆圆 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
薄丹丹 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
谢杰 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
贾启越 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
冯建高 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
冯昶 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
范广勤 330006 南昌大学公共卫生学院,江西省预防医学重点实验室
摘要: 目的  研究低剂量汞、铅和镉联合暴露对大鼠海马神经元的损伤。方法  采用2×2×2析因设计将人神经母细胞瘤细胞按随机数字表法随机分为8组,染毒24 h、48 h和72 h后,检测各组细胞活力值。将20只8周龄SD孕鼠按随机数字表法随机分配至4组(每组5只),分别为对照组(蒸馏水)、1倍3种重金属混合物暴露组(1×MM组,氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为0.15、25.00、7.50 mg/L),5倍3种重金属混合物暴露组(5×MM组,氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为0.75、125.00、37.50 mg/L)和10倍3种重金属混合物暴露组(10×MM组,氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为1.50、250.00、75.00 mg/L),饮水染毒至孕鼠分娩。分娩后,每组选择20只雄性仔鼠先经母乳染毒至断乳,调整染毒剂量后经饮水染毒至成年(出生后83 d)处死。采集大鼠血样和海马组织,观察海马超微结构变化,并测定血中汞、铅、镉含量及海马神经元细胞凋亡率、活性氧和细胞内游离钙([Ca2+]i)荧光强度值。结果  染毒48 h和72 h后,汞+铅+镉联合暴露(未观察到有害作用浓度,分别为1.0、0.5和0.1 μmol/L)对细胞活力影响具有协同毒性(P值均<0.05)。动物实验发现1×MM组较对照组比较变化不明显,5×MM组海马神经元开始出现线粒体减少、嵴和基质逐渐溶解,10×MM组加重出现明显的核内染色质聚集成团、线粒体大量减少且嵴与基质大量溶解。1×MM组、5×MM组、10×MM组大鼠血中汞、铅和镉含量均高于对照组,差异具有统计学意义(P值均<0.001)。1×MM组海马神经元细胞凋亡率与对照组的差异无统计学意义,5×MM组和10×MM组细胞凋亡率均高于对照组,差异具有统计学意义(P值均<0.001)。1×MM组海马神经元活性氧荧光强度值与对照组的差异无统计学意义,5×MM组和10×MM组活性氧荧光强度值均高于对照组,差异具有统计学意义(P值均<0.05)。1×MM组海马神经元[Ca2+]i荧光强度值与对照组的差异无统计学意义,5×MM组和10×MM组[Ca2+]i荧光强度值均高于对照组,差异具有统计学意义(P值均<0.001)。结论  低剂量汞、铅和镉联合暴露可引起协同神经毒性损伤,可能与海马神经元凋亡、活性氧及[Ca2+]i变化有关。
关键词 :重金属中毒,神经系统;暴露;协同毒性;大鼠海马
Cellular damage of low-dose combined exposure to mercury, lead and cadmium on hippocampal neurons in rats
LiZongguang,ZhouFankun,YinGuangming,GaoYanyan,JiangXin,LiuSisi,ZhangYuanyuan,BoDandan,XieJie,JiaQiyue,FengJiangao,FengChang,FanGuangqin     
School of Public Health/Jiangxi Provincial Key Laboratory of Preventive Medicine, Nanchang University, Nanchang 330006, China
Corresponding author: Fan Guangqin, Email: fanguangqin@ncu.edu.cn
Abstract:Objective  To observe the cellular damage of low-dose combined exposure to Hg, Pb and Cd on hippocampal neurons in rat.Methods  SH-SY5Y cells were randomly divided into 8 groups by 2×2×2 factorial design: control group, Pb exposure group, Hg exposure group, Pb+Hg exposure group, Pb+Cd exposure group, Hg+Cd exposure group and Pb+Cd+Hg exposure group. And the cell viabilities were measured. On this basis, an animal model was established. Twenty eight-week-old SD pregnant rats were randomly divided into four groups by random number table, and five in each group: the control group(distilled water), 1-fold metal mixture exposure group (1×MM, poisoning solution containing mercury chloride 0.15 mg/L, lead acetate trihydrate 25 mg/L, cadmium chloride 7.5 mg/L), 5-fold metal mixture exposure group (5×MM, poisoning solution containing mercury chloride 0.75 mg/L, lead acetate trihydrate 125.00 mg/L, cadmium chloride 37.50 mg/L), 10-fold metal mixture exposure group (10×MM, poisoning solution containing mercury chloride 1.50 mg/L, lead acetate trihydrate 250.00 mg/L, cadmium chloride 75.00 mg/L). Pregnant rats drank water until delivery. Twenty male pups were selected and exposed to these metals through breast milk until weaned. The heavy metals dose of poisoning water was adjusted, and then the weaned rats were exposed to heavy metals via drinking poisoning water until adulthood (postnatal day 83). The blood samples and brain hippocampus samples were collected to observe the ultrastructural changes of hippocampus, and to determine the levels of Hg, Pb and Cd in blood. In addition, apoptosis rate and fluorescence intensity of reactive oxygen species and intracellular free calcium concentration ([Ca2+]i) in hippocampal neurons were measured.Results  Cellular factorial design analysis showed that Hg+Pb+Cd (at no observed adverse effect level, 1.0, 0.5 and 0.1 μmol/L, respectively)had a interaction on cell viability after 48 or 72 hours of combined exposure (P<0.05). The results of ultrastructure showed that mitochondria decreased, ridges and matrixes gradually dissolved in rat hippocampal neurons of 5×MM group; nuclear chromatin aggregated, more ridges and matrixes dissolved and the mitochondria also decreased in rat hippocampal neurons of 10×MM group. The concentration of Hg, Pb and Cd in the blood of 1×MM group, 5×MM group and 10×MM group were higher than those in the control group, and the differences were statistically significant (P<0.001). There was no significant difference in apoptosis rate between the 1×MM group and the control group. The apoptosis rate of 5×MM group and 10×MM group was higher than that in the control group, and the differences were statistically significant (P<0.001). There was no statistically significant difference in the fluorescence intensity of reactive oxygen species in hippocampal neurons of the 1×MM group and the control group. The fluorescence intensity of reactive oxygen species in the 5×MM group and the 10×MM group was higher than that in the control group, the difference was statistically significant (P<0.05). There was no significant difference in the fluorescence intensity of [Ca2+]i between the 1×MM group and the control group. The fluorescence intensity values of [Ca2+]i in the 5×MM group and the 10×MM group were higher than the control group, the differences were statistically significant (P<0.001).Conclusion  Low-level combined exposure to Hg, Pb, and Cd caused synergistic neurotoxic damage, and the process may be related to the changes of neuronal apoptosis, reactive oxide species, and [Ca2+]i levels.
Key words :Heavy Metal Poisoning, nervous system;Exposure;Synergistic toxicity;Rat hippocampus
全文

环境重金属污染已成为严重影响人群健康的公共卫生问题之一[1]。据2017年《综合环境反应、赔偿和责任法》最新发布的毒物优先列表排序所示,前十名毒物中包含3种重金属,分别为汞、铅和镉[2]。有研究表明,汞、铅和镉在工业和生活上常用、污染严重且生物效应强,对人体基本无有益生理作用,但均可在一般人群血样和尿样中被检出[3,4]。目前,单一重金属所造成的健康损害已得到广泛而深入的研究。然而在实际环境中,这些重金属并非单独存在,而以低剂量混合形式共存于环境中。因此,对单一重金属高剂量暴露下的毒性研究,已难以适用于实际环境中低剂量重金属混合物的毒理效应评估及相应的风险评价,研究多种重金属的低剂量联合暴露所致毒性效应具有更为重要的现实意义[5,6]。环境中的汞、铅和镉存在于多种形式的化合物中,本研究选择重金属神经毒性研究中应用最广泛的氯化汞、醋酸铅和氯化镉开展实验[7,8,9],观察低剂量汞、铅和镉联合暴露致大鼠海马的超微结构的病理损伤,并探索可能的海马神经元损伤机制,为重金属联合暴露所致神经毒性及健康风险评估提供科学依据。

材料与方法  

一、材料  

1.受试细胞与试剂:  人神经母细胞瘤细胞株(human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y)细胞系购自美国典型培养物保藏中心(America Type Culture Collection, ATCC)。三水合醋酸铅和氯化镉购自美国Sigma公司;氯化汞购自西亚试剂公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Becton Dickinson公司;CCK-8型细胞活力检测试剂盒和Fluo-4-AM胞内游离钙(intracellular free calcium concentration, [Ca2+]i)检测试剂盒均购自日本Dojindo公司;DCFH-DA活性氧检测试剂盒购自美国Sigma公司。

2.仪器:  EnSpire酶标仪购自美国PerkinElmer公司;AFS-8330冷原子荧光光谱仪(cold vapor atomic fluorescence spectrometry, CV-AFS)购自北京吉天公司;NexION 300X电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)购自美国PerkinElmer;Tecnai G2 Spirit Bio TWIN透射电子显微镜购自美国FEI公司;Lab Quanta SC flow cytometer流式细胞仪购自美国Beckman-Conlter公司。

二、方法  

1.细胞培养及细胞活力检测:  将SH-SY5Y细胞系置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱,采用10%胎牛血清完全培养基进行培养。传代调整密度为5×103个细胞/孔,以每孔200 μl接种至96孔细胞培养板。根据3种重金属汞、铅和镉的浓度梯度(分别为0、0.001、0.01、0.10、0.25、0.50、1.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μmol/L),得出其未观察到有害作用水平(no observed adverse effect level,NOAEL),并以此作为细胞实验的染毒浓度,采用2×2×2析因设计开展实验。实验按随机数字表法随机分为8组,每组设置6个复孔,并设立无细胞的空白孔,进行3次独立实验。染毒24、48、72 h后,每孔加入10 μl的CCK-8工作液,37 ℃孵育2 h,采用酶标仪检测各孔吸光度值,测量波长为450 nm。细胞活力(%)=(暴露组吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照组吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。

2.实验动物模型建立:  选取体重200~250 g的8周龄清洁级SD大鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证43004700030623),适应性喂养1周后进行合笼配对。在配对期间采用阴道凃片法检查雌鼠受孕情况,将确定怀孕的雌鼠按随机数字表法随机分为4组(每组5只),分别为对照组(蒸馏水)、1倍3种重金属混合物暴露组(1×MM组,氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为0.15、25.00、7.50 mg/L)、5倍3种重金属混合物暴露组(5×MM组,氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为0.75、125.00、37.50 mg/L)和10倍3种重金属混合物暴露组(10×MM组,氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为1.50、250.00、75.00 mg/L)。染毒液的配置过程需加入0.1%冰醋酸助溶,配制后置于聚四氟乙烯容器中室温避光保存。饲养期间,雌鼠自由摄取饲料,并控制昼夜循环(12/12 h)和室温(22±1)℃,直至产下仔鼠。仔鼠在断乳后,继续通过饮水染毒。考虑到仔鼠断乳前后存在胎盘和血乳屏障的差异,以及重金属在动物体内的吸收、分布、代谢、排除以及蓄积情况,本研究根据预实验结果调整了仔鼠饮水暴露的剂量:对照组(蒸馏水)、1×MM组(氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为0.05、8.33、1.00 mg/L)、5×MM组(氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为0.25、41.65、5.00 mg/L)、10×MM组(氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉含量分别为0. 50、83.30、10.00 mg/L)。将各组仔鼠饲养至成年(出生后83 d)后处死。

3.动物血液元素含量检测:  取动物血液1 ml于聚四氟乙烯消解管中,加入4 ml浓HNO3和2 ml质量分数30% H2O2后,采用微波消解仪进行微波消解,结束后并赶酸,待冷却后备用。采用CV-AFS进行汞的测定[10],ICP-MS进行铅、镉的检测[11,12]。为确保试验结果准确可靠,在实验过程中同时做样品加标试验,汞、铅、镉的加标回收率分别为95.0%~103.0%、98.0%~105.0%、99.0%~106.0%,相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)分别为2.30%、1.60%和2.54%,检出限分别为0.014、0.001和0.001 μg/L。

4.海马超微结构损伤检测:  将鼠麻醉,剪开胸腔,用生理盐水从左心室主动脉至右心耳灌注,待血液冲洗干净后,用质量分数4.0%多聚甲醛缓慢灌进。固定完成后,取脑并分离海马CA1区,切成1×1×1 mm3组织块。经质量分数2.5%的戊二醛和质量分数1.0%的锇酸双重固定、酒精脱水、置换、包埋并修整后,进行半薄切片定位,以厚度40~80 nm进行切片,乙酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色。在透射电镜10 000倍和50 000倍下,分别观察细胞核及细胞器损伤情况。

5.流式细胞仪检测海马神经元损伤情况[13]  脱颈处死动物后,立即取出大脑海马组织,将其剪碎为小块,用质量分数0.125%的胰酶37 ℃消化18 min,然后加入10%的胎牛血清并终止消化,制成细胞悬液后用网筛过滤。进行台盼蓝拒染实验,血细胞计数板镜下计数,以2×105个细胞/ml接种于6孔细胞培养板,置于37 ℃体积分数5% CO2培养箱进行预培养1 h,400×g离心5 min沉淀细胞。按照DCFH-DA活性氧检测试剂盒、Fluo-4-AM胞内游离钙检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的操作说明书,采用流式细胞仪分别检测神经元细胞的活性氧、[Ca2+]i荧光强度值及细胞凋亡率。

三、统计学分析  数据录入及统计分析均采用SPSS 22.0软件。细胞活力、血液中汞、铅和镉含量、细胞凋亡率、细胞内[Ca2+]i及活性氧荧光强度值均符合正态分布,以±s表示;不同染毒剂量组间细胞活力、血液中汞、铅和镉含量、细胞凋亡率、[Ca2+]i荧光强度值及活性氧荧光强度值比较采用单因素方差分析,两两比较采用Dunnett-t检验。汞、铅和镉的交互作用采用2×2×2析因设计资料方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.汞、铅和镉联合暴露对SH-SY5Y细胞损伤的影响:  汞、铅和镉对SH-SY5Y细胞活力影响的NOAEL分别为1.0、0.5和0.1 μmol/L。单因素方差分析发现,染毒24 h后各组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05),染毒48 h和72 h后各组细胞活力的差异有统计学意义(P值均<0.05)。两两比较发现,染毒48 h和72 h时,与对照组相比,铅+镉+汞组细胞活力下降,差异具有统计学意义(P值均<0.05),具体结果见表1。染毒48 h和72 h后,汞、铅和镉联合暴露对细胞活力的影响均具有交互作用(P值均<0.05),铅镉联合、汞铅联合及铅汞联合均未发现交互作用(P值均>0.05),具体结果见表2

表1不同组别SH-SY5Y细胞活力的变化情况(%, ±s, n=3)
表2不同染毒时间下汞、铅和镉对SH-SY5Y细胞活力影响的交互作用(n=3)

2.大鼠血液中汞、铅和镉元素含量的测定:  1×MM组、5×MM组、10×MM组大鼠血液中汞、铅和镉含量均高于对照组,差异具有统计学意义(P值均<0.001)。其中1×MM组大鼠血液中3种重金属含量,与中国一般人群的血液含量(血汞、铅、镉分别为1.81、34.90、0.49 μg/L)相近。具体见表3

表3不同染毒剂量下大鼠血中重金属汞、铅和镉的含量(μg/L, ±s, n=10)

3.低剂量汞、铅和镉联合暴露对大鼠海马神经元超微结构的影响:  在透射电镜的10 000倍和50 000倍镜下分别观察海马神经元细胞核和细胞器形态发现,对照组大鼠神经元形态较成熟,核膜光滑,染色质均匀分布,细胞器较丰富,细胞线粒体呈椭圆形粒状,线粒体嵴分布清晰。1×MM组较对照组变化不明显;5×MM组开始出现细胞器数目减少,部分线粒体轻度肿胀,部分嵴断裂,基质变淡,但核膜仍光滑,染色质均匀分布;而在10×MM组,大鼠海马神经元出现核内染色质聚集成团、边集(图1),但核膜尚完整,细胞器数目稀少,线粒体出现较严重的肿胀,嵴断裂融散,模糊不清,并有大量空泡形成(图2)。

图1不同剂量的染毒液对大鼠海马神经元细胞器的影响(×10 000)图A为对照组(蒸馏水);图B为1×MM组(母鼠和仔鼠染毒液的氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉浓度分别为0.15、25.00、7.50 mg/L和0.05、8.33、1.00 mg/L);图C为5×MM组(母鼠和仔鼠染毒液的氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉浓度分别为0.75、125.00、37.50 mg/L和0.25、41.65、5.00 mg/L);图D为10×MM组(母鼠和仔鼠染毒液的氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉浓度分别为1.50、250.00、75.00 mg/L和0. 50、83.30、10.00 mg/L)
图2不同染毒剂量对大鼠海马神经元细胞器的影响(×50 000)图A为对照组(蒸馏水);图B为1×MM组(母鼠和仔鼠染毒液的氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉浓度分别为0.15、25.00、7.50 mg/L和0.05、8.33、1.00 mg/L);图C为5×MM组(母鼠和仔鼠染毒液的氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉浓度分别为0.75、125.00、37.50 mg/L和0.25、41.65、5.00 mg/L);图D为10×MM组(母鼠和仔鼠染毒液的氯化汞、三水合醋酸铅、氯化镉浓度分别为1.50、250.00、75.00 mg/L和0. 50、83.30、10.00 mg/L)

4.不同剂量的染毒液对大鼠海马神经元细胞凋亡、[Ca2+]i及活性氧的影响:  (1)细胞凋亡率:流式细胞仪检测结果发现,各染毒剂量组大鼠海马神经元细胞凋亡率的差异具有统计学意义(F=58.75,P<0.001)。两两比较发现,5×MM和10×MM组大鼠海马神经元细胞凋亡率较对照组分别增加了22.46%、59.69%(P值均<0.001)。(2)[Ca2+]i荧光强度值:各染毒剂量组大鼠海马神经元[Ca2+]i荧光强度值的差异具有统计学意义(F=25.60,P<0.001)。两两比较发现,5×MM和10×MM组海马神经元[Ca2+]i荧光强度值较对照组分别增加了17.66%、30.68%(P值均<0.001)。(3)活性氧荧光强度值:各染毒剂量组大鼠海马神经元活性氧荧光强度值的差异具有统计学意义(F=15.90,P<0.001)。两两比较发现,5×MM和10×MM组海马神经元活性氧荧光强度值较对照组分别增加了15.25%、28.34%(P值均<0.05)。具体见表4

表4不同剂量的染毒液对大鼠海马神经元细胞的影响(±s, n=5)

讨论  本研究成功建立了近似中国一般人群血液中汞、铅和镉浓度水平的大鼠模型[3],为以后研究3种重金属低剂量联合暴露的健康效应奠定了基础。海马组织是边缘系统的重要组成部分,是调控大脑学习记忆功能的关键区域,而且在脑内对损伤也最为敏感[14]。本研究发现,5×MM和10×MM组大鼠海马神经元细胞核内染色质聚集成团、边集,且线粒体和嵴的数量均有较为明显的减少。G?ssowska等[15]对铅所致大鼠细胞超微结构损伤的研究发现,受到损伤的细胞特点为线粒体被拉长、肿胀和萎缩以及嵴和基质溶解。Cupertino等[16]开展的镉所致大鼠细胞超微结构损伤研究发现,超微结构的损伤程度与暴露剂量存在剂量依赖性。这在一定程度上支持本研究结论。
        以往研究表明,氧化应激、钙稳态失调和细胞凋亡是重金属致细胞毒性损伤的共同机制[17]。本研究发现,5×MM和10×MM组大鼠海马神经元细胞凋亡率、[Ca2+]i及活性氧荧光强度值较对照组均有相应增加,与电镜结果一致。Kim和Sharma[18]研究发现,高剂量的汞暴露可导致细胞凋亡、活性氧及[Ca2+]i水平增加。Xu等[19]在PC12细胞上对高剂量的镉暴露所致细胞损伤的机制进行了探讨,发现细胞凋亡、[Ca2+]i及活性氧水平均出现增加。然而,他们所研究的单个重金属暴露剂量均相对较高,这也一定程度上支持本研究低剂量汞、铅和镉联合暴露对大鼠海马细胞损伤具有协同作用这一结论。综合大鼠海马超微结构的损伤及其细胞凋亡、[Ca2+]i及活性氧水平的变化,汞、铅和镉联合暴露可能导致大鼠海马神经元内发生氧化应激,氧自由基的动态平衡异常,引起活性氧增加,使细胞膜脂质过氧化且膜上相关酶活力丧失,进而致其通透性增强,细胞外Ca2+大量内流[20,21]。细胞内钙超载后,使神经系统的物质交换和能量代谢发生紊乱,导致细胞凋亡,线粒体受损。
        综上所述,汞、铅和镉低剂量联合暴露可引起协同神经毒性损伤。近似中国一般人群血液水平的汞、铅和镉低剂量联合暴露,可致大鼠海马神经元的超微结构损伤,且可能与神经元细胞凋亡、细胞内活性氧及游离钙水平变化有关。由于细胞和动物实验结论外推的不确定性,本研究结论需要在进一步的人群相关实验研究中证实。

参考文献
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