中华预防医学杂志    2018年10期 亚砷酸钠对人肝星状细胞活化及细胞外基质分泌的影响    PDF     文章点击量:57    
中华预防医学杂志2018年10期
中华医学会主办。
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范丽丽 陈雄 邹忠兰 王大朋 张爱华
FanLili,ChenXiong,ZouZhonglan,WangDapeng,ZhangAihua
亚砷酸钠对人肝星状细胞活化及细胞外基质分泌的影响
Effects of sodium arsenite exposure on activation and extracellular matrix secretion of human hepatic stellate cells
中华预防医学杂志, 2018,52(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.10.004

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投稿日期: 2018-05-15
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亚砷酸钠对人肝星状细胞活化及细胞外基质分泌的影响
范丽丽 陈雄 邹忠兰 王大朋 张爱华     
范丽丽 550025 贵阳,贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室 卫生毒理学教研室
陈雄 550025 贵阳,贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室 卫生毒理学教研室
邹忠兰 550025 贵阳,贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室 卫生毒理学教研室
王大朋 550025 贵阳,贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室 卫生毒理学教研室
张爱华 550025 贵阳,贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室 卫生毒理学教研室
摘要: 目的  探讨不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)暴露对人肝星状细胞活化及主要细胞外基质(ECM)分泌的影响。方法  采用不同浓度NaAsO2(0.0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L)处理体外培养的人肝星状细胞株(Lx-2)24、48、72 h后,采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率,计算半数抑制浓度(IC50);根据IC50结果,采用0.000、1.875、3.750、7.500、15.000 μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞24 h,另以7.500 μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞0、12、24、48、72 h,到达处理终点收集细胞沉淀及培养上清。采用Western blot法检测Lx-2细胞活化相关蛋白表达水平,包括α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子-β1(TGF-β1);ELISA法检测培养上清主要用于ECM分泌水平,包括透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(COL-IV)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)。结果  随NaAsO2处理浓度的增加,Lx-2细胞存活率逐渐下降,其中50.0、100.0 μmol/L砷暴露组在24、48和72 h时,细胞存活率较0.0 μmol/L组均明显降低(P<0.05);处理24、48、72 h的IC50分别为72.75、48.19和29.95 μmol/L。肝星状细胞活化相关蛋白检测结果发现,1.875、3.750、7.500、15.000 μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞24 h后,α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平均高于0.000 μmol/L,且在7.500 μmol/L剂量组蛋白表达差异最大(P<0.05)。7.500 μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞0、12、24、48、72 h后,α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平亦随染毒时间的增加而升高(P<0.05)。ECM分泌水平检测显示,1.875、3.750、7.500、15.000 μmol/L NaAsO2处理24 h后,HA、LN、COL-Ⅳ和PⅢNP分泌水平均高于0.000 μmol/L组(P<0.05)。7.500 μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞0、12、24、48、72 h后,HA、LN、COL-Ⅳ和PⅢNP分泌水平均高于对照组(P<0.05)。结论  NaAsO2可上调肝星状细胞活化相关蛋白表达,诱导其进一步活化,进而增加细胞外基质分泌水平。
关键词 :细胞外基质;肝;肝纤维化;亚砷酸钠;肝星状细胞
Effects of sodium arsenite exposure on activation and extracellular matrix secretion of human hepatic stellate cells
FanLili,ChenXiong,ZouZhonglan,WangDapeng,ZhangAihua     
Key Laboratory of Environmental Pollution Monitoring and Disease Control, Ministry of Education, Department of Toxicology, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China
Corresponding author: Wang Dapeng, Email: wangdapeng@gmc.edu.cn
Abstract:Objective  To explore the effects of sodium arsenite (NaAsO2) exposure on the activation and extracellular matrix secretion of human hepatic stellate cells, and to provide a theoretical basis for the mechanism study of arsenic induced hepatic fibrosis.Methods  Different doses of NaAsO2 (0.0, 0.1, 1.0, 10.0, 50.0, 100.0 μmol/L) were exposed to human hepatic stellate cell line (Lx-2) for 24, 48 and 72 huors. CCK-8 assay was used to measure cell viability and IC50 of NaAsO2 on Lx-2 was then calculated; According to IC50 results, 0.000, 1.875, 3.750, 7.500, and 15.000 μmol/L of NaAsO2 were exposed to Lx-2 cells for 24 hours, besides, 7.500 μmol/L of NaAsO2 was exposed to Lx-2 cells for 0, 12, 24, 48, and 72 hours, then collected cells and culture supernatant; HSC activation-related protein, including α-smooth muscle actin (α-SMA), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) expression levels were detected by Western blot analysis, the main extracellular matrix including laminin (LN) , hyaluronic acid (HA), collagen Ⅳ (COL-Ⅳ) and procollagen Ⅲ(P Ⅲ NP) secretion level was detected by Elisa assay.Results  CCK-8 assay showed that the cell viability of Lx-2 cells were increased obviously at low doses (≤1.0 μmol/L) of arsenic exposure, especially at 48 and 72 h. In contrast, with the increasing doses of arsenic exposure, the survival rate of Lx-2 cell was decreased gradually, and the survival rate of the high-dose (50, 100 μmol/L) arsenic exposure group at 24, 48 and 72 h were significantly lower than 0.0 μmol/L group, P<0.05. The IC50 of NaAsO2 on Lx-2 cells at 24, 48, 72 h were calculated as 72.75, 48.19 and 29.95 μmol/L, respectively; The expression levels of HSC activation-related protein showed that, after treated with 1.875, 3.750, 7.500, 15.000 μmol/L NaAsO2 for 24 h, α-SMA and TGF-β1 protein level were higher than 0.000 μmol/L group. The increased expression of α-SMA and TGF-β1 protein were most significant in 7.500 μmol/L NaAsO2 group (P<0.05). In addition, the expression levels of α-SMA and TGF-β1 also showed a time-dependent increasing in Lx-2 cells after treated with 7.500 μmol/L NaAsO2 for 0, 12, 24, 48 and 72 h; Elisa assay showed that after treated with 1.875, 3.750, 7.500, 15.000 μmol/L NaAsO2 for 24 h, the secretion levels of HA, LN, COL-Ⅳ and PⅢNP were obvious higher than 0.000 μmol/L group (P<0.05). Moreover, the secretion levels of HA, LN, COL-Ⅳ and P Ⅲ NP also showed a time-dependent increased manner in Lx-2 cells after exposed to 7.500 μmol/L NaAsO2 for 0, 12, 24, 48 and 72 h (P<0.05).Conclusion  NaAsO2 exposure to Lx-2 cells can upregulate the expression level of HSC activation-related proteins, induce its further activation, then increase ECM secretion level.
Key words :Extracellular matrix;Liver;Liver fibrosis;Sodium arsenite;Hepatic stellate cell
全文

砷中毒是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。近年来研究发现,砷中毒除可引起典型的皮肤损害以外,还可导致不同程度的肝损害,如肝炎性损害、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌[1,2,3]。其中肝纤维化因具有可逆性特点而受到国内外学者的广泛关注,亦成为当前砷中毒肝损伤研究热点。研究已知,肝纤维化是各种致病因子引起的以各类胶原[如Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ, COL-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ, COL-Ⅳ)等]、层粘连蛋白(laminin, LN)和氨基聚糖[如透明质酸(hyaluronic acid, HA)]等为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积为特征的病理生理过程,是各类慢性肝病(如肝硬化、肝癌等)的共同病理基础[4]。其中肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化是肝纤维化发生的中心环节,亦是ECM产生的主要来源[5,6]。各种因素暴露导致肝脏细胞受损后,能够释放各类炎症因子及促纤维化细胞因子,启动多条信号转导通路促进HSC活化标志物[如转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等]的表达来激活HSC[7]。因此,深入探讨引起HSC活化及ECM分泌的分子机制对肝纤维化的防治具有重要意义。
        目前关于砷暴露对HSC活化及ECM分泌的影响研究报道甚少。基于此,本研究探讨了不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)暴露对Lx-2细胞活化及ECM分泌的影响,为砷中毒肝纤维化损伤机制研究提供理论基础。

材料与方法  

1.细胞:  正常人肝星状细胞系Lx-2细胞购自中南大学湘雅细胞库。

2.主要仪器与试剂:  主要仪器有CO2培养箱(INCO2108型,德国Memmert公司)、高速冷冻离心机(2K15型,美国Sigma公司)、稳压稳流定时电泳仪(PowerPac HC,美国Bio Rad公司)、蛋白电泳/转膜槽(美国Bio Rad公司)、凝胶成像系统(ChemiDocTMXRS+,美国Bio Rad公司)、多功能酶标仪(Multiskan? GO型,美国Thermo Fisher公司)、超纯水纯化系统(美国millipore公司)。主要试剂有DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司),DMSO(美国Sigma公司),细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8型,碧云天生物技术研究所),ELISA试剂盒(上海基免实业有限公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所),α-SMA、TGF-β1一抗(美国CST公司),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗(美国Immunoway公司),羊抗鼠/羊抗兔二抗(碧云天生物技术研究所),PVDF膜、ECL发光液、彩虹蛋白Maker(美国millipore公司)。

3.细胞培养及NaAsO2毒性实验:  正常人肝星状细胞系Lx-2细胞接种于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素及4 mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中,37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养。常规传代培养,取生长状态良好,且处于对数生长期的细胞按5×103/孔密度接种于96孔细胞培养板,将NaAsO2以0.0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L的浓度梯度对Lx-2细胞进行染毒(6孔/组),染毒时间分别为24、48、72 h,用CCK-8试剂盒测定不同时间Lx-2细胞存活率并计算IC50,实验重复三次。

4.实验分组:  (1)量-效关系研究:根据细胞毒性试验所得半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)结果,以IC50浓度的0、1/16、1/8、1/4、1/2作为染毒剂量进行实验(浓度分别为0.000、1.875、3.750、7.500、15.000 μmol/L),处理时间为24 h。(2)时-效关系研究:以IC50的1/4(7.500 μmol/L)为NaAsO2处理剂量,观察不同时间(0、12、24、48、72 h)后Lx-2细胞活化及ECM分泌情况。

5.α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平检测:  到达各处理终点收集细胞沉淀,加入适量RIPA(强)裂解液,冰浴40 min后于16 000×g离心20 min,收集上清,采用BCA法进行蛋白浓度测定。Western blot法检测α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平:依次进行制胶、蛋白上样(20 μg)、电泳、转膜、牛血清白蛋白(albumin from bovine serum, BSA)封闭后,将α-SMA、TGF-β1和GAPDH蛋白一抗分别按1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000进行4 ℃孵育过夜,采用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温孵育90 min,利用ECL化学发光法进行显影。采用Quantity One软件进行蛋白条带灰度值分析。

6.ECM分泌水平检测:  到达各处理终点收集细胞培养上清,采用ELISA检测上清液中HA、LN、COL-Ⅳ和Ⅲ型前胶原氨基端肽(procollagen Ⅲ, PⅢNP)分泌水平,具体操作严格按照各Elisa试剂盒说明书进行,利用Curve Expert软件进行结果分析。

7.统计学分析:  采用SPSS 17.0软件对所有实验数据进行统计分析,Excel 2007进行数据统计。Lx-2细胞存活率、α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平及HA、LN、COL-Ⅳ、PⅢNP分泌水平经检验均符合正态分布,且具有方差齐性,采用±s表示,采用单因素方差分析对其进行比较,两两比较采用LSD法进行。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.不同浓度NaAsO2对Lx-2细胞存活率的影响:  如表1所示,低剂量砷暴露(≤1.0 μmol/L)48、72 h时Lx-2细胞存活率增加。50.0、100.0 μmol/L砷暴露组在染毒24、48、72 h后Lx-2细胞存活率低于0.0 μmol/L组(P<0.05)。计算得到24、48和72 h的IC50分别为72.75、48.19和29.95 μmol/L。

表1不同浓度NaAsO2处理不同时间后Lx-2细胞存活率(%,±sn=3)

2.不同浓度NaAsO2处理24 h对Lx-2细胞活化相关蛋白表达的影响:  如表2所示,随着NaAsO2处理浓度的增加,Lx-2细胞中α-SMA蛋白表达水平逐渐升高,其中7.500 μmol/L剂量组升高最为明显(P<0.05);3.750 μmol/L剂量组及以下,TGF-β1蛋白表达水平差异无统计学意义,而在7.500和15.000 μmol/L剂量组中则呈现明显高表达,以7.500 μmol/L剂量组最高。

表2不同浓度NaAsO2处理24 h后Lx-2细胞活化相关蛋白表达水平(±sn=3)

3.7.500 μmol/L NaAsO2处理不同时间对Lx-2细胞活化相关蛋白表达的影响:  如表3所示,随着NaAsO2处理时间的延长,Lx-2细胞中α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平均升高,其中72 h处理时间其表达水平升高幅度最大。

表37.500 μmol/L NaAsO2处理不同时间后Lx-2细胞活化相关蛋白表达(±sn=3)

4.不同浓度NaAsO2处理24 h对Lx-2细胞ECM分泌水平的影响:  结果显示,随着NaAsO2处理浓度的增加,Lx-2细胞主要ECM的分泌水平均升高,其中HA和LN分泌水平增高较多(表4)。

表4不同浓度NaAsO2处理24 h后Lx-2细胞ECM分泌水平(ng/ml,±sn=3)

5.7.500 μmol/L NaAsO2处理不同时间对Lx-2细胞ECM分泌水平的影响:  结果显示,随着NaAsO2处理时间的延长,Lx-2细胞主要ECM分泌水平均升高,其中48 h和72 h时分泌水平上升最为明显。与量-效关系研究结果一致,HA和LN分泌水平亦增高(表5)。

表57.500 μmol/L NaAsO2处理不同时间后Lx-2细胞ECM分泌水平(ng/ml,±sn=3)

讨论  肝纤维化是肝硬化、肝癌的前期必经阶段,其主要病理改变表现为肝内弥漫性ECM合成与降解失衡,致其在肝脏内过度沉积[8]。如前言所述,HSC的活化是肝纤维化发生发展的始动环节,亦是ECM产生的主要来源[6,7]。因此,研究HSC活化及其ECM分泌情况对阐明各致病因子引发肝纤维化的具体机制尤为关键。目前砷暴露对体外HSC的增殖、活化尤其是ECM分泌的影响尚不清楚且少有报道。
        砷暴露对细胞增殖的影响存在双向效应,即低剂量下可促进细胞增殖,高剂量下则抑制其增殖水平[9]。本研究结果显示低剂量(≤1.0 μmol/L)砷暴露可促进Lx-2细胞增殖水平,随着砷处理浓度的增加其增殖率则逐渐下降,其原因可能与砷暴露存在低剂量兴奋效应密切相关。此外,本研究还观察到低剂量(≤1.0 μmol/L)砷暴露48 h和72 h后Lx-2细胞增殖水平增加最为显著,其原因可能与Lx-2细胞在48~72 h进入对数生长期有关,具体机制有待进一步探讨。
        HSC活化涉及多种细胞因子参与,其中α-SMA表达增加已被公认为HSC活化的主要标志。除此之外,TGF-β1作为组织损伤后的强效致纤维化因子,亦被证实为启动静息状态HSC活化和转化的标志之一[10]。本研究发现不同浓度砷暴露不同时间均可引起人肝星状细胞中α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平升高,且呈现一定量-效和时-效关系,说明砷暴露能够明显诱导HSC活化。与本研究结果一致,吴顺华等[11]对大鼠肝星状细胞进行无机砷暴露同样发现不同浓度和不同时间砷处理均可引起大鼠肝星状细胞培养上清中α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ分泌水平增加。
        ECM是一类聚集在细胞表面和间质的大分子物质,其中HA、LN、COL-Ⅳ和PⅢNP作为ECM的代表性成分,目前已被广泛应用于肝纤维化损伤的诊断和辅助诊断当中[12,13]。其中HA是结缔组织的重要组成成分,其在肝纤维化发生过程中可明显升高,是反映肝纤维化和慢性炎症改变最敏感的指标[14];LN是形成基底膜的基本骨架,其在正常肝组织中含量较低,而当肝纤维化发生时,HSC、肝细胞、内皮细胞等均参与合成分泌LN,并在肝窦内大量沉积[14,15];PⅢNP分泌水平升高与汇管区容积及周围成纤维细胞数量明显相关,同时亦与肝纤维化活动程度密切相关,可反映肝纤维发生发展的动态过程[16];COL-Ⅳ是基底膜的主要成分之一,当肝纤维化发生时,基底膜结构会改变甚至被破坏,导致COL-Ⅳ合成与沉积明显增加[17]。本研究发现砷暴露诱导Lx-2细胞活化的同时亦可引起HA、LN、COL-Ⅳ和PⅢNP分泌水平明显升高,且均呈现较好的量-效关系和时-效关系。课题组前期砷中毒人群研究显示HA是评价砷致肝纤维化损伤相对最敏感的生物学标志,且COL-Ⅳ和PⅢNP在肝纤维化病情发展的中后期表现具有特异性[18]。本研究结果亦提示砷暴露诱导HSC活化的同时亦可干扰ECM分泌水平,其动态监测对砷致肝纤维化发生发展的早期诊断和预防具有重要意义。
        综上可知,砷暴露可诱导体外培养的人肝星状细胞进一步活化,增加其ECM的分泌水平,该过程可能为砷致肝纤维化发生发展的关键环节。因此,进一步探讨砷暴露引起肝星状细胞上述系列改变的具体分子机制对砷致肝纤维化损伤的针对性防治尤为必要。

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