中华预防医学杂志    2018年10期 缺氧诱导因子1α在砷所致人肝细胞上皮间质转化及其恶性转化中的作用    PDF     文章点击量:50    
中华预防医学杂志2018年10期
中华医学会主办。
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戴翔宇 陈超 王大朋 张爱华 刘起展
DaiXiangyu,ChenChao,WangDapeng,ZhangAihua,LiuQizhan
缺氧诱导因子1α在砷所致人肝细胞上皮间质转化及其恶性转化中的作用
Hypoxia-inducible factor-1α is involved in arsenite-induced epithelial-mesenchymal transition and malignant transformation of human liver epithelial cells via regulating Snail
中华预防医学杂志, 2018,52(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.10.005

文章历史

投稿日期: 2018-05-15
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缺氧诱导因子1α在砷所致人肝细胞上皮间质转化及其恶性转化中的作用
戴翔宇 陈超 王大朋 张爱华 刘起展     
戴翔宇 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学教育部重点实验室
陈超 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学教育部重点实验室
王大朋 贵州医科大学公共卫生学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室
张爱华 贵州医科大学公共卫生学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室
刘起展 211166 南京医科大学公共卫生学院现代毒理学教育部重点实验室
摘要: 目的  探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在亚砷酸钠(NaAsO2)所致人肝细胞(L-02细胞)上皮-间质转化(EMT)及其在恶性转化中的作用。方法  用2.0 μmol/L NaAsO2慢性处理L-02细胞0、10、20或30代,以0代为对照组。用LipofectamineTM2000将缺氧诱导因子1α对照小干扰RNA(con siRNA)和HIF-1α小干扰RNA(siRNA)转染砷诱导的恶性转化人肝细胞(T-L-02)后,将其分别设定为T-L-02+con siRNA和T-L-02+HIF-1α siRNA组,并设立L-02组及T-L-02对照组。采用Western blots检测不同组别的EMT指标及HIF-1α表达水平,采用双荧光素酶报告基因实验检测HIF-1α与Snail的结合水平,软琼脂集落形成实验检测细胞恶性程度,侵袭转移实验检测细胞侵袭转移能力。结果  NaAsO2处理10、20和30代L-02细胞后,其E-钙黏附蛋白水平均低于0代细胞组,P值均<0.05;而N-钙黏附蛋白和转录因子Snail相对表达量及HIF-1α水平均高于0代细胞组,P值均<0.05。siRNA处理后,T-L-02+HIF-1α siRNA组的HIF-1α、N-钙黏附蛋白、Snail水平低于T-L-02对照组,而细胞E-钙黏附蛋白水平高于T-L-02对照组,P值均<0.05。同时,HIF-1α直接靶向Snail调控其表达,使其表达升高。细胞侵袭实验发现,T-L-02+HIF-1α siRNA组细胞的集落形成数、侵袭细胞数和转移细胞数均低于T-L-02对照组,P值均<0.05。结论  HIF-1α通过调控Snail参与砷所致人肝细胞EMT及其恶性转化。
关键词 :亚砷酸盐类;缺氧诱导因子1;上皮-间质转化;细胞恶性转化
Hypoxia-inducible factor-1α is involved in arsenite-induced epithelial-mesenchymal transition and malignant transformation of human liver epithelial cells via regulating Snail
DaiXiangyu,ChenChao,WangDapeng,ZhangAihua,LiuQizhan     
The Key Laboratory of Modern Toxicology, Ministry of Education, School of Public Health, Nanjing Medical University, Nanjing 211166, China
Corresponding author: Liu Qizhan, Email: qzliu@njmu.edu.cn
Abstract:Objective  To investigate the role of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in arsenite-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) and malignant transformation of human liver epithelial cells (L-02 cells).Methods  After the L-02 cells were chronic treated with 2.0 μmol/L NaAsO2 for 0 (reference), 10, 20, or 30 passages, con siRNA or HIF-1α siRNA was transfected into arsenite-transformed L-02 (T-L-02) cells by lipofectamineTM2000 and were set as T-L-02+con siRNA group and T-L-02+HIF-1α siRNA group as well as L-02 group and T-L-02 group, EMT index and levels of HIF-1α were detected by western blots. The reporter assays were performed to determine if HIF-1α directly regulate Snail transcriptional activity, and soft agar colony formation and Transwell assay were used to detect the malignancy, invasion, and migration ability of cells.Results  When L-02 cells were treated for 10 generations with 2 μmol/L NaAsO2, relative expressions of E-cadherin were gradually increased compared to control cells, while the levels of N-cadherin, Snail, and HIF-1α were gradually increased in the L-02 cells compared to control cells, showing the longer the treatment time was, the more obvious the change was (P<0.05) . Down regulating the level of HIF-1α by siNRA caused E-cadherin levels to rise compared to T-L-02 group, while the levels of N-cadherin and Snail fall back compared to T-L-02 group (P<0.05) . Double luciferase reporter gene assays showed that HIF-1α directly targeted Snail to regulate its expression. Soft agar colony formation and Transwell assays showed that the numbers of formed colonies, invasion cells, and metastasis cells of cells in T-L-02 group were all lower than those in L-02 group (P<0.05) .Conclusion  HIF-1α is involved in arsenite-induced EMT and malignant transformation of human liver epithelial cells via regulating Snail.
Key words :Arsenites;Hypoxia-inducible factor 1;Epithelial-mesenchymal transition;Cell malignant transformation
全文

砷暴露是常见的环境与职业有害因素,人们主要通过吸烟、吸入和(或)摄入污染的空气和食品(如大米及其制品)而暴露于低水平砷[1]。砷中毒造成人体多器官和多系统损害,如肺癌、皮肤癌和肝癌等[2,3],其中肝硬化和肝癌是砷中毒常见疾病,我国特有的燃煤型砷中毒临床上表现为以皮肤和肝脏损害为主,肝硬化腹水及癌症为主要死因[4]。目前关于砷化物致癌的分子机制尚不明确,对于砷暴露所致损伤尚无有效的诊断指标及治疗药物[5],仍需进一步的研究。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指的是在特定的病理生理情况下,具有极性的上皮细胞失去上皮细胞特性并获得间质样细胞特性的现象[6],可在转录水平促使恶性肿瘤细胞发生侵袭转移[7]。有研究发现具有多种调节功能的转录因子缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)在介导砷所致氧化应激和缺氧细胞早期损害效应以及恶性转化过程中发挥重要作用[8,9,10],提示HIF可能在砷所致肝损害和肝癌中发挥作用,但其具体的分子机制研究报道甚少。本研究探讨HIF-1α在亚砷酸钠(NaAsO2)所致人肝细胞发生EMT及其恶性转化中的作用。

材料与方法  

1.主要试剂:  NaAsO2(99%纯度)购自美国Sigma公司;胎牛血清、RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司;一抗甘油醛-3-磷酸脱氢(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)购自美国Sigma公司;一抗E-钙黏附蛋白(E-cadherin)、N-钙黏附蛋白(N-cadherin)、锌指转录因子Snail和缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)购自美国Abcam公司;二抗经辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase,HRP)标记过的羊抗小鼠IgG购自美国KPL公司;LipofectamineTM2000高效转染试剂购自美国Invitrogen公司;对照小干扰RNA(control small interfering RNA,con siRNA)和HIF-1α小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)购自美国Santa Cruz公司。

2.细胞培养及处理:  L-02细胞购自中科院上海细胞库,在37 ℃含体积分数为5% CO2的细胞恒温培养箱中培养,使用含有100 IU/ml链霉素和青霉素的混合双抗溶液及10%胎牛血清的RPMI-1640培养液进行培养。诱导细胞发生恶性转化:1×106个L-02细胞种于100 mm培养皿中,培养24 h后,倒掉原有培养液,加入含有0(对照组)或2 μmol/L NaAsO2的新鲜RPMI-1640完全培养液,继续培养48~72 h至细胞基本长满即可传代,使用相同培养方式培养细胞至30代。根据上述方法,通过软琼脂集落实验和Transwell实验鉴定,证明本实验室已成功建立NaAsO2慢性处理所致恶性转化L-02细胞(T-L-02)模型[11]

3.Western blots检测蛋白水平:  二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium,BCA)法定量蛋白样品后,与5 ×蛋白上样缓冲液混合,100 ℃处理5 min;等量蛋白上样,用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)90 V 150 min进行蛋白分离;转移至聚偏二氟乙烯膜上,300 mA 2 h;5%脱脂牛奶室温封闭1 h;各自加入蛋白一抗,4 ℃孵育过夜;再加入相应的二抗,室温孵育60 min,加显色底物,曝光成像。

4.细胞转染实验:  准备好实验所需的细胞,接种于6孔板内,待细胞汇合度到50%时进行转染。转染液配制:无血清培养液稀释Con siRNA、HIF-1α siRNA后,室温孵育5 min,为A液;无血清培养液稀释Lipofectamine 2000后,室温孵育5 min,为B液;将A液和B液混匀后,室温孵育30 min,为C液。将无血清培养液与C液混匀后,加至待处理细胞中,转染4~6 h后,更换新鲜培养液,构建T-L-02+con siRNA和T-L-02+HIF-1α siRNA组。

5.双荧光素酶报告基因实验:  运用启动子预测网站(http://www.ensembl.org/index.html),预测在Snail启动子区构造。将野生型或突变型psiCHECK-2 Snail报告基因质粒分别与HIF-1α-siRNA共转染实验所需的细胞4~6 h后,换新鲜培养液培养24~48 h后收集细胞。将上述收集到的细胞重悬后加至不透光的96孔细胞培养板中,按照Promega公司Dual-Luciferase Reporter试剂盒步骤操作,检测荧光素酶活性。每个样品重复测定3次后,统计荧光素酶活性值。

6.软琼脂集落形成实验:  高压灭菌后的1.4%低熔点琼脂糖中加入新鲜培养液,配制成质量分数为0.7%的低熔点琼脂糖;取6孔细胞培养板,按照每个孔1 ml的量加入6孔细胞培养板中,轻轻滴入,保证无气泡产生,置于酒精上促使其凝固;细胞悬液于琼脂糖按3∶1的比例混匀,保证接种细胞数为1×104/100 cm2,轻轻滴入铺好的琼脂糖的6孔细胞培养板中,防止底层被吹起,等待其凝固;凝固后的6孔细胞培养板中各加入适量培养液,3~4 d加入一次,3~4周后可终止培养,并在倒置显微镜下计数,其中含有的细胞≥50个才可被记为细胞集落。

7.转移与侵袭实验:  取适量基质胶于冰中并置于4 ℃融解,并将所需器具4 ℃预冷;取出4 ℃融解的基质胶,吸取100 μl于1.5 EP管,加入500 μl 4 ℃预冷的RPMI-1640无血清培养液,轻轻混匀避免有气泡产生(稀释比例1∶5)。每个Transwell小室中加入35 μl步骤2中稀释好的基质胶,覆盖整个聚碳酯膜,避免气泡产生,置于37 ℃,30 min后,使其聚合成胶;胰酶消化液消化处理好的细胞并离心后用RPMI-1640无血清培养液悬浮,并进行细胞计数,可取5×105个/ml加入100 μl于Transwell小室中,根据细胞迁移侵袭能力大小设定,即每孔5×104个;取24孔板,每孔加入500 μl含5%~10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,再把聚合成胶的Transwell小室轻轻放入,每Transwell小室中加入100 μl细胞悬液;仔细观察,确保上室与下室间隙之间没有气泡,并把24孔板放入37 ℃细胞培养箱孵育24 h(期间1~2 h后取出查看确认间隙中没有气泡);孵育24 h后取出24孔板,用PBS洗Transwell小室1~2次,然后用棉签轻轻擦去Matrigel胶和膜表面的细胞,倒置,风干;加入500 μl免疫荧光固定液于24孔板中,固定10~30 min后,风干;取出Transwell小室,放入装有500 μl结晶紫染液的24孔板,染色10~15 min左右后,用超纯水洗涤冲洗3次;室温放置风干,显微镜下拍照,计数。

8.统计学分析:  采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。E-钙黏附蛋白、N-钙黏附蛋白、转录因子Snail、HIF-1α水平相对表达灰度值、荧光素酶活性值、集落形成和侵袭转移相对数属于正态分布,以±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.NaAsO2慢性处理对L-02细胞EMT和HIF-1α水平的影响:  用2.0 μmol/L NaAsO2慢性处理L-02细胞0、10、20或30代后,结果发现NaAsO2慢性处理10、20和30代L-02细胞上皮细胞指标E-cadherin水平均低于对照组,而间质细胞指标N-cadherin水平,EMT转录因子Snail水平及HIF-1α水平均高于0代对照组,均具有一定的时间-效应关系,即随处理时间的延长(细胞恶性程度增加),其变化越明显(表1)。提示NaAsO2慢性处理引起L-02细胞发生EMT并引起HIF-1α水平升高。

表1NaAsO2处理不同代数L-02细胞后EMT相关蛋白和HIF-1α水平相对表达量(±sn=3)

2.NaAsO2慢性处理对L-02细胞EMT的影响:  结果发现HIF-1α siRNA处理后T-L-02细胞HIF-1α水平低于未处理的对照T-L-02细胞,而且下调HIF-1α水平后,T-L-02细胞上皮指标E-cadherin水平也高于未处理的对照T-L-02细胞,而间质指标N-cadherin水平和EMT转录因子Snail水平低于未处理的对照T-L-02细胞(表2)。提示HIF-1α在NaAsO2所致L-02细胞EMT过程中发挥重要作用。

表2HIF-1α siRNA处理下T-L-02细胞EMT相关蛋白相对表达量(±sn=3)

3.HIF-1α对L-02细胞Snail表达的调控作用及NaAsO2对其影响:  预测发现在Snail启动子区的-538~-538和-549~-553均存在缺氧反应原件(图1)。并且双荧光素酶报告基因实验检测发现,NaAsO2处理的L-02细胞Snail转录活性高于对照细胞;而通过siRNA下调HIF-1α的L-02细胞Snail转录活性低于NaAsO2处理L-02细胞Snail转录活性(表3)。说明HIF-1α介导了NaAsO2所致的L-02细胞Snail水平的升高,并且直接靶向调控Snail转录活性。

表3HIF-1α siRNA及NaAsO2处理下T-L-02细胞Snail转录活性(±sn=3)
图1人肝细胞Snail启动子区的缺氧反应原件示意图

4.NaAsO2慢性处理对恶性转化L-02细胞恶性程度和侵袭转移的影响:  结果发现T-L-02细胞在软琼脂上形成的集落数、侵袭和转移细胞数高于对照L-02细胞(图2表4);而通过siRNA下调HIF-1α的T-L-02细胞在软琼脂上形成的集落数、侵袭细胞数和转移细胞数低于单独T-L-02细胞(图3表4)。提示HIF-1α在NaAsO2慢性处理L-02细胞恶性转化中发挥着重要作用。

表4HIF-1α siRNA处理下恶性转化L-02细胞集落形成数以及侵袭和转移细胞数
图2软琼脂集落形成实验中缺氧诱导因子1α对恶性转化正常人肝细胞恶性程度以及侵袭和转移能力的影响图A为正常人肝细胞;图B为砷诱导的恶性转化人肝细胞;图C为缺氧诱导因子1α小干扰RNA处理组;图D对照小干扰RNA处理组
图3侵袭转移实验中HIF-1α对恶性转化L-02细胞恶性程度以及侵袭和转移能力的影响

讨论  砷污染导致的健康危害至少威胁22个国家和地区的5 000万人口,其中我国是受其危害较为严重的国家之一[12,13,14]。因此,砷污染已经成为全世界广泛关注的严重环境问题之一[15,16]。砷中毒造成人体多器官和多系统损害,长期砷暴露引起皮肤癌、肺癌和肝癌等多种癌症。因此,砷化物已被国际癌症研究机构确认为人类确定(Ⅰ类)致癌物[17]。目前国内外有很多关于砷化物致癌的机制假说,其中包括氧化应激、染色体异常、信号通路改变、表观遗传改变等[18]
        EMT与肿瘤的发生发展密切相关,EMT过程中细胞形态会发生改变,由原来的鹅卵石圆形细胞逐渐变成长梭形的纺锤样细胞;其次基因表达也会随之改变,表现为上皮样分子标志物如E-cadherin水平降低,间质样分子标志物如N-cadherin水平增加[19]。因为这些改变,细胞的侵袭转移能力也随之增加,所以EMT被认为是肿瘤发生发展过程中的一个重要环节[20,21]。EMT是一个动态的过程,多种转录因子如Snail、Slug和ZEB1/2参与其中。Snail是一个重要的EMT转录因子,首先在果蝇中被发现,可直接抑制E-cadherin蛋白的表达,进而诱导上皮间质转化,E-cadherin被认为是Snail直接作用的靶基因。Snail主要以锌指区域与E-cadherin启动子上的E-Box作用元件结合从而抑制E-cadherin的转录,Snail的显著表达与E-cadherin的下调密切相关,异常表达Snail的上皮细胞显示成纤维细胞的表现型,并且获得肿瘤发生和侵袭的特性[22,23]
        EMT在NaAsO2所致细胞恶性转化中也发挥重要作用。本课题组前期研究发现,1.0 μmol/L NaAsO2慢性处理HaCaT细胞,可以诱导HaCaT细胞发生EMT,从而发生恶性转化而具有侵袭转移能力[24]。本研究结果显示,2.0 μmol/L NaAsO2慢性处理人正常肝上皮L-02细胞10代开始,引起L-02细胞E-cadherin水平降低,而N-cadherin和Snail水平升高,并具有一定的时间-效应关系,即随处理时间延长(细胞恶性程度增加)细胞发生EMT越明显。细胞软琼脂集落形成和Transwell实验检测发现,T-L-02细胞集落数、侵袭细胞数和转移细胞数均显著高于正常L-02细胞。说明NaAsO2引起L-02细胞发生EMT及恶性转化。
        HIFs除了在缺氧条件下发挥转录调控作用外,在正常氧条件下,许多环境化学物的暴露均能诱导其稳定表达从而发挥其转录调控的功能[25]。HIFs的家族成员HIF-1α通过对其近50种靶基因的调控在胚胎发育、血管生成与重塑、糖酵解、细胞凋亡、细胞增殖分化、炎症、肿瘤生长等诸多方面发挥重要的调控作用[26]。本研究说明下调HIF-1α水平可逆转L-02细胞发生的EMT。
        细胞软琼脂集落形成和Transwell实验检测发现,通过siRNA下调HIF-1α表达后的T-L-02细胞形成的集落数、侵袭细胞数和转移细胞数均低于T-L-02细胞,从而提示下调HIF-1α可以引起T-L-02细胞恶性程度和侵袭转移能力降低,说明HIF-1α在NaAsO2所致L-02细胞发生EMT及恶性转化中发挥重要作用。
        为了进一步研究HIF-1α如何调控NaAsO2所致L-02细胞发生EMT及其恶性转化,本研究运用基因启动子区分析网站预测发现,EMT转录因子Snail启动子区存在2个HRE结合区域(5'- CGTG-3'),而且应用siRNA下调HIF-1α表达后则可明显阻滞NaAsO2慢性处理所致细胞Snail水平升高,使用双荧光素酶报告基因实验证实HIF-1α可与Snail启动子区结合。说明HIF-1α通过调控Snail参与NaAsO2所致L-02细胞发生EMT及其恶性转化。
        综上,本研究发现慢性NaAsO2暴露引起L-02细胞HIF-1α水平升高而调控Snail转录水平,从而引起L-02细胞发生EMT和恶性转化而具有侵袭转移能力。为进一步探讨砷化物所致细胞恶性转化的分子机制,及防控砷中毒所致健康危害的早期生物学标志和拮抗靶标提供了理论依据和科学线索。

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