中华预防医学杂志    2018年10期 三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统的建立及评价    PDF     文章点击量:64    
中华预防医学杂志2018年10期
中华医学会主办。
0

文章信息

魏双萍 范飞 陈洁 柳欣林 杨与柔 王致萍 宋硕 李智海 魏旻希 王大宁 李少伟 夏宁邵
WeiShuangping,FanFei,ChenJie,LiuXinlin,YangYurou,WangZhiping,SongShuo,LiZhihai,WeiMinxi,WangDaning,LiShaowei,XiaNingshao
三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统的建立及评价
Establishment and evaluation of a triple-color human papillomavirus pseudovirion neutralization assay
中华预防医学杂志, 2018,52(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.10.014

文章历史

投稿日期: 2017-12-08
上一篇:2015年中国部分非监测试点地区医疗机构乙型肝炎住院病例报告及诊断现状
下一篇:2012—2016年天津市猩红热患儿A组链球菌病原学特征分析
三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统的建立及评价
魏双萍 范飞 陈洁 柳欣林 杨与柔 王致萍 宋硕 李智海 魏旻希 王大宁 李少伟 夏宁邵     
魏双萍 361102 厦门大学生命科学学院
范飞 361102 厦门大学生命科学学院
陈洁 361102 厦门大学生命科学学院
柳欣林 361102 厦门大学生命科学学院
杨与柔 361102 厦门大学生命科学学院
王致萍 361102 厦门大学生命科学学院
宋硕 361102 厦门大学生命科学学院
李智海 361102 厦门大学生命科学学院
魏旻希 厦门万泰沧海生物技术有限公司
王大宁 361102 厦门大学公共卫生学院
李少伟 361102 厦门大学生命科学学院;361102 厦门大学公共卫生学院
夏宁邵 361102 厦门大学生命科学学院;361102 厦门大学公共卫生学院
摘要: 目的  建立三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统,并评价其在检测HPV九价疫苗免疫血清免疫原性的应用。方法  分别选取红色、绿色和蓝色荧光蛋白的质粒N31-MCHREEY、N31-EGFP和N31-mTagBFP构建HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒,利用双抗夹心法和病毒半数组织培养感染剂量法检测HPV假病毒浓度和感染滴度;利用单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒,检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和滴度,以验证三色混合荧光HPV假病毒系统的准确性;采用单色荧光和三色混合荧光HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒系统检测HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清的中和滴度,判断其是否可应用于HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测。结果  含有绿色、红色和蓝色荧光质粒的HPV16型假病毒的浓度为5~6 μg/ml,HPV6/11/18/31/33/45/52/58的三色混合荧光假病毒浓度为1~3 μg/ml。获得了分别含有EGFP、Mcherry和mTagBFP报告基因的9个型别的HPV假病毒,且满足中和检测需要;9个型别单色荧光HPV假病毒的滴度值均在1×104~1×105之间,即它们具有相似的感染滴度。检测HPV九价疫苗免疫的小鼠血清时,单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒系统所得中和滴度值差异均无统计学意义(P值均>0.05);检测HPV九价疫苗免疫的食蟹猴血清时,单色荧光与三色混合荧光A、B和C组HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒所得中和滴度值差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论  成功地建立了三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统;验证其与单色荧光HPV假病毒系统具有一致性;证实其可应用于检测HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测中。
关键词 :疫苗;中和试验;免疫血清;人乳头瘤病毒;三色荧光假病毒
Establishment and evaluation of a triple-color human papillomavirus pseudovirion neutralization assay
WeiShuangping,FanFei,ChenJie,LiuXinlin,YangYurou,WangZhiping,SongShuo,LiZhihai,WeiMinxi,WangDaning,LiShaowei,XiaNingshao     
National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases, State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China
Corresponding author: Li Shaowei, Email: shaowei@xmu.edu.cn
Abstract:Objective  To establish a triple-color pseudovirion-based neutralization assay (PBNA) and evaluate its capability of detecting immunogenicity of the sera generated by the immunization of HPV 9-valent vaccine.Methods  HPV pseudovirus (PsVs) 6/11/16/18/31/33/45/52/58 with the encapsidated fluorescence expressing red fluorescent plasmid N31-MCHREEY, green fluorescent N31-EGFP or blue fluorescent N31-mTagBFP were generated. The concentration of HPV PsVs and the infection titers of HPV PsVs were detected by double-antibody sandwich ELISA and TCID50, respectively. The single- and triple color HPV 16/33/45 PsVs were used to detect the neutralization titers of mice sera immunized with HPV 9-valent vaccine and confirmed the accuracy and specificity of the triple-color PBNAs. Then, the single- and triple color HPV 6/11/18/31/33/45/52/58 PsVs were employed to detect the neutralization titers of cynomolgus macaques sera immunized with HPV 9-valent vaccine and determined whether the triple-color PBNAs could be applied to evaluate the immunogenicity of the sera generated by the immunization of HPV9-valent vaccine.Results  The concentration of HPV16 PsVs encapsulating green, red or blue fluorescent plasmid was 5.0 to 6.0 μg/ml and HPV6/11/18/31/33/45/52/59 triple-color HPV PsVs was about 1.0 to 3.0 μg/ml. 9 types HPV PsVs containing EGFP, Mcherry or mTagBFP reporter plasmid were obtained and the concentration can meet the need of neutralization detection. 9 types single-color fluorescent HPV PsVs had similar infectivity against 293FT cells with the infection titer values between 1×104 and 1×105. The results of PBNAs showed that there was no significant difference in the anti-HPV neutralization titers of mice sera induced by HPV 9-valent vaccine between single-color and triple-color HPV16/33/45 PsVs (P>0.05). Similarly, there was also no significant difference in the anti-HPV neutralization titers of cynomolgus macaques sera induced by HPV 9-valent vaccine between single-color and triple-color HPV6/11/18/31/33/45/52/58 PsVs (P>0.05).Conclusion  We successfully established the triple-color PBNAs and verified the accuracy and specificity of triple-color PBNAs consistent with single-color PBNAs. The triple-color PBNAs can be applied to evaluate the immunogenicity of HPV 9-valent vaccine's immune serum.
Key words :Vaccine;Neutralization tests;Immune sera;Human papillomavirus;HPV triple-color pseudovirus
全文

HPV感染可导致宫颈癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和尖锐湿疣等生殖器恶性和良性病变,严重威胁人类健康[1,2,3]。流行病学研究发现,至少存在15种可引起恶性肿瘤的高危型HPV[4]。目前,HPV疫苗是预防其感染的有效方法,临床研究表明,接种HPV疫苗后诱导机体产生的抗体能有效的阻碍HPV的感染,进而预防宫颈癌的发生[5,6]。相关研究表明,只有中和抗体可成功的阻碍HPV感染,非中和抗体并无此功能,因此检测疫苗免疫血清中的中和抗体滴度是评价疫苗保护效果的金标准[7]。但目前无法获得HPV真病毒用于中和检测,只能体外培养HPV假病毒代替真病毒用于中和检测实验[8],而国内外通用的检测HPV疫苗免疫血清中和滴度的HPV假病毒均为单色的绿色荧光HPV假病毒[9,10],这导致在HPV九价疫苗免疫血清中和检测实验中,同一份血清需要分别使用9种单色HPV假病毒分别检测,导致血清中和检测的工作量十分巨大繁琐,影响临床试验进程。为解决这一问题,本研究选取了绿色、蓝色和红色荧光3种不同荧光报告基因构建三色混合荧光HPV假病毒,同时结合荧光酶联免疫斑点检测仪检测不同波长的荧光强度,并将其成功地应用于HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清抗体滴度评价。现将结果阐述如下。

材料与方法  

一、材料  

1.菌株来源:  DH5α株大肠埃希菌为厦门大学国家诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保藏菌株;构建HPV假病毒所用的质粒为p6shell、pVITRO-HPV11 L1-L2、p16shell、p18shell、p31shell、pVITRO-HPV33 L1-L2、p45shell、p52shell和p58shell,均购自美国Addgene公司;293FT细胞购自美国Invitrogen公司。

2.HPV抗体和实验动物:  (1)抗体:Western blot实验所用羊抗鼠的酶标辣根过氧化物酶抗体;HPV16主要衣壳蛋白抗体1D12和21A5,HPV16型病毒次要衣壳蛋白抗体14H6以及交叉中和抗体4H4和12B9均由厦门大学国家诊断试剂与疫苗工程技术研究中心构建,其中4H4是针对HPV16/33型病毒的交叉中和抗体,12B9是针对HPV33/58型病毒的交叉中和抗体。(2)实验动物:实验用BaLb/c小鼠12只(SPF级,6周龄,雌鼠,体重约20 g),购自上海斯莱克实验动物有限公司;食蟹猴12只(2周岁,雌性,约3.5 kg)购自上海药明康德新药开发有限公司。

3.主要试剂和仪器:  聚醚酰亚胺转染专用试剂购自美国Invitrogen公司;DMEM培养基购自美国GIBCO公司;优级胎牛血清购自德国PAA公司;牛血清白蛋白购自德国AppliChem公司;HPV16/18双价疫苗和HPV九价疫苗与铝佐剂为厦门大学国家诊断试剂与疫苗工程技术研究中心制备[10,11]

二、实验方法  

1.携带不同荧光质粒的HPV假病毒制备:  参照文献[12,13,14]中方法,选取红色荧光蛋白的质粒N31-MCHREEY(简称RFP)、绿色荧光蛋白的质粒N31-EGFP(简称GFP)和蓝色荧光蛋白的质粒N31-mTagBFP(简称BFP)分别构建不同型别HPV假病毒;构建的HPV假病毒具体为,蓝色荧光HPV16/31/33/45/52/58型假病毒,红色荧光HPV6/16/18/31/33/45/52/58型假病毒,绿色荧光HPV6/11/16/18/31/33/45型假病毒。

2.HPV假病毒浓度检测:  采用HPV L1抗体病毒样颗粒构象性双抗夹心系统测量携带不同荧光质粒的HPV假病毒的浓度,具体检测方法详见参考文献[15]。

3.HPV假病毒滴度鉴定:  首先将293FT细胞按照1×105每孔铺在96孔细胞培养板中4 h左右,然后采用系列稀释的方法进行病毒滴度检测,将HPV假病毒10倍梯度倍稀,稀释6个梯度,每个稀释倍数8孔重复,将稀释后的病毒转移至96孔细胞培养板中,37 ℃培养72 h后,荧光酶联免疫斑点检测仪检测每孔的荧光数,进而计算出HPV假病毒的滴度值。

4.HPV病毒样颗粒疫苗免疫血清制备:  (1)HPV16/18双价疫苗免疫小鼠血清:将0.1 μg的HPV16/18双价疫苗按照免疫程序为第0、2和4周接种BaLb/c,并于第8周采眼球血,获得HPV16/18双价疫苗免疫鼠血清。(2)HPV九价疫苗免疫小鼠血清:将1.0 μg的HPV九价疫苗按照免疫程序为第0、2和4周随机接种6只BaLb/c小鼠,并于第8周采眼球血,获得HPV九价疫苗免疫小鼠血清;其余6只接种空白佐剂。(3)HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清:将13.5 μg的HPV九价疫苗按照免疫程序为第0、1和6个月随机接种6只食蟹猴,并于第12周采集静脉,获得HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清;其余6只接种空白佐剂。

5.三色混合荧光HPV假病毒系统的建立:  根据HPV各型别的亲缘关系,选取亲缘关系较远的3个HPV型别且病毒浓度(1.0 μg/ml以上)和感染滴度(1×104以上)均正常的绿色、红色和蓝色荧光HPV假病毒进行组合,根据计算的病毒感染滴度分别取相应体积的绿色、红色和蓝色荧光HPV假病毒于无菌的0.5 ml EP管中进行混匀形成三色混合荧光HPV假病毒,用于后续中和检测。

三、三色混合荧光HPV假病毒系统的验证、应用和评价  

1.系统一致性验证:  随机选择亲缘关系较远的3个HPV型别(HPV16/33/45)建立单色和三色混合荧光HPV假病毒系统,分别检测HPV九价疫苗免疫的6只小鼠血清,3次重复实验,通过比较单色和三色混合荧光HPV16/33/45假病毒检测所得的中和滴度值的一致性,验证三色混合荧光HPV假病毒系统的准确性。具体分组如下:(1)单色荧光HPV16/33/45假病毒系统分为A、B、C组,即单独绿色、红色、蓝色荧光HPV16/33/45假病毒。(2)三色混合荧光HPV16/33/45假病毒系统:A组为绿色荧光HPV16假病毒、红色荧光HPV33假病毒和蓝色荧光HPV45假病毒混合;B组为蓝色荧光HPV16假病毒、红色荧光HPV33假病毒和绿色荧光HPV45假病毒混合。检测方法参考文献[16]。

2.系统应用与评价:  为避免因HPV进化亲缘关系较近导致血清交叉,而造成干扰中和检测的结果,故选择亲缘关系较远的组成3个HPV型别混合搭配。采用单色和三色混合荧光HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒分别检测HPV九价疫苗免疫的6只食蟹猴血清,3次重复实验,进一步评价三色混合荧光HPV假病毒系统是否可应用于九价疫苗血清检测。分组如下:(1)单色荧光HPV假病毒:单独绿色HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒。(2)三色混合荧光HPV假病毒A组:绿色荧光HPV6假病毒、蓝色荧光HPV16假病毒和红色荧光HPV52假病毒混合;绿色荧光HPV11假病毒、蓝色荧光HPV33假病毒和红色荧光HPV45假病毒混合;红色荧光HPV18假病毒、绿色荧光HPV31假病毒和红色荧光HPV58假病毒混合。(3)三色混合荧光HPV假病毒B组:绿色荧光HPV6假病毒、红色荧光HPV18假病毒和蓝色荧光HPV52假病毒;绿色荧光HPV11假病毒、蓝色荧光HPV31假病毒和红色荧光HPV33假病毒混合;蓝色荧光HPV16假病毒、绿色荧光HPV45假病毒和红色荧光HPV58假病毒混合。(4)三色混合荧光HPV假病毒C组:红色荧光HPV6假病毒、绿色荧光HPV18假病毒和蓝色荧光HPV58假病毒混合;绿色荧光HPV11假病毒、红色荧光HPV31假病毒和蓝色荧光HPV52假病毒混合;绿色荧光HPV16假病毒、蓝色荧光HPV33假病毒和红色荧光HPV45假病毒混合。实验步骤参考文献[1014]。

四、统计学分析  采用SPSS 22.0软件进行数据整理和统计学分析。血清中和检测滴度值经lg转换后符合正态分布,以±s表示,并采用方差分析比较不同组间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

一、不同荧光质粒构建HPV假病毒的浓度和滴度  

1.HPV假病毒浓度检测:  含有绿色、红色和蓝色荧光质粒的HPV16型假病毒的浓度为5~6 μg/ml,HPV6/11/18/31/33/45/52/58的三色混合荧光假病毒浓度为1~3 μg/ml。

2.HPV假病毒滴度检测:  如表1所示,HPV的9个型别不同荧光假病毒的滴度值均在1×104~1×105之间,表明所有假病毒均具有较高的感染能力,可用于后续中和检测。

表1采用3种荧光质粒构建不同型别HPV假病毒的感染滴度值

二、三色混合荧光HPV假病毒系统验证  单独绿色荧光、三色混合荧光A组中绿色以及B组中蓝色HPV16假病毒的中和检测滴度分别为4.01±0.29、3.84±0.28和3.78±0.31(F=1.01,P=0.387)。单独绿色荧光、三色混合荧光A组中红色以及B组中红色HPV33假病毒检测的中和滴度均为4.31±0.45、4.26±0.32和4.26±0.32(F=0.04,P=0.964)。单独绿色荧光、三色混合荧光A组中蓝色以及B组中绿色HPV45假病毒的中和检测滴度分别为4.31±0.45、4.11±0.42、4.03±0.41(F=0.37,P=0.698)。即三色混合荧光HPV假病毒系统与单色荧光HPV假病毒系统具有一致性。

三、三色混合荧光HPV假病毒系统的应用和评价  如表2所示,HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58单色荧光HPV假病毒与A、B和C组三色混合荧光HPV假病毒检测血清的中和滴度值差异均无统计学意义(P值均>0.05)。即三色混合荧光HPV假病毒系统可应用于HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性实验。

表2单色荧光与三色混合荧光HPV假病毒系统检测HPV九价疫苗免疫血清的中和滴度比较(±s

讨论  本研究结果显示,三色假病毒均含有L1和L2蛋白,且L2蛋白分子量明显比理论值偏高,相对分子质量接近80 000,这与已报道的HPV假病毒性质一致[17]。本研究结果显示,三色混合荧光HPV假病毒检测血清的中和滴度与单荧光HPV假病毒检测血清的中和滴度值几乎完全一致,且三色混合荧光HPV假病毒混合后检测血清不存在干扰现象,完全可以应用于HPV九价疫苗免疫血清中和检测。同时进一步验证了不同组合方式的三色混合荧光HPV假病毒可以较好地应用于HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清的中和检测,检测结果与单色荧光HPV假病毒的高度一致,为高效快速地检测HPV九价疫苗临床血清奠定了坚实基础。
        HPV预防性疫苗能有效阻碍病毒感染的基础是可以有效地刺激机体免疫系统产生高滴度的中和抗体,而HPV假病毒-细胞中和检测是评价HPV预防性疫苗是否具有保护作用的不可替代的方法[18]。除了中和检测方法,ELISA也被应用于HPV疫苗血清抗体滴度检测,但ELISA检测的是血清中总抗体的含量,由于存在大量的抗体不具有中和能力,即不能阻碍病毒感染,因此这一方法不能准确的判断疫苗的效价。然而HPV假病毒-细胞中和检测的复杂性和许多限制因素,导致检测操作中存在许多困难,例如高滴度的HPV假病毒生产,培养活性较好的293FT细胞,无菌操作和检测周期较长等。为了克服这些局限,本课题组前期在HPV假病毒生产这一方面进行了优化,利用悬浮的293FT悬浮细胞和美国通用GE医疗系统有限公司研制的波浪式生物反应器大规模制备HPV假病毒[19]。在中和结果检测方面,目前已使用多波长的荧光免疫斑点检测仪快速的读取中和数据。
        目前国内厦门万泰生物技术有限公司研制的HPV九价疫苗和美国默沙东公司的HPV九价疫苗均取得国内临床批件,九价疫苗免疫血清需要检测9个型别,常用的HPV假病毒均为携带绿色荧光报告基因,导致9个型别HPV假病毒需要单独检测,而临床血清标本量巨大,这大大制约了临床血清中和检测的效率,影响临床实验进程。而三色混合荧光HPV假病毒系统解决了这一问题,由于自然界中可见光的波长范围接近,可供选择的不同颜色荧光种类有限。综合考虑不同颜色荧光的发射光和激发光的波长范围,这3种荧光可以混合使用而不产生相互干扰:绿色荧光的激发光为465~495 nm,发射光为505 nm;红色荧光的激发光为555~585 nm,发射光为610 nm;蓝色荧光的激发光为340~380 nm,发射光为420 nm,实验表明这三种颜色的荧光蛋白在其他波长下不产生明显的颜色干扰,且进一步研究也表明携带不用荧光报告基因的HPV假病毒在中和检测结果中具有高度的一致性,这表明HPV假病毒具有很高的适用性,可以携带各种报告基因而不影响其感染能力,如早期以携带碱性磷酸酶为报告基因的HPV假病毒,目前常用的携带GFP为报告基因的HPV假病毒,还包括用于小鼠阴道感染模型的携带luc报告基因的HPV假病毒。
        在HPV九价疫苗中,根据亲缘关系9个型别的HPV被分为3种,分别是A7、A9和A10,A7包括HPV18/45,A9包括两簇,分别是HPV16和31以及HPV33/52/58,A10类包括HPV6/11[20]。每一簇均是亲缘关系较近几个型别HPV,所以这几簇中几个型别之间免疫产生的中和抗体存在一定的交叉,如HPV6免疫会产生一定量的HPV11的中和抗体,同样HPV11免疫也会产生一定量的HPV6中和抗体[21],这就决定在三色混合荧光HPV假病毒组合选择时要针对性的避免这几簇型别出现在同一个三色混合荧光组合中。本研究选取的3组三色混合荧光HPV假病毒的组合均能够有效的检测HPV九价疫苗免疫血清的中和抗体滴度,且检测结果均与单色荧光检测的一致,这3组不同的组合方式均可用于今后HPV九价疫苗临床血清中和检测。
        综上所述,本研究基于EGFP、Mcherry和mTagBFP荧光报告基因建立了三色混合荧光HPV假病毒检测系统,3种荧光蛋白混合后不存在干扰现象,且单色HPV假病毒中和检测结果与三色检测结果具有高度一致性,该三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统可用于HPV九价疫苗临床血清中和检测,对提高HPV九价疫苗临床试验效率具有重要意义。

参考文献
[1]倪红霞,许国章,张姝,等.宁波市妇女宫颈癌和人乳头瘤病毒感染的流行病学调查[J].国际病毒学杂志,2017,24(1):44-49. DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2017.01.011.
[2]卫飞雪,郭蒙,马心静,等.男性包皮环切对外生殖器HPV感染自然史影响的前瞻性研究[J].中华预防医学杂志,2018,52(5):486-492. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9024.2018.05.007.
[3]狄江丽,罗晓敏,吴久玲,等. 2014年中国农村妇女宫颈高危型人乳头瘤病毒感染状况及亚型分布[J].中华预防医学杂志,2017,51(4):325-331. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.04.009.
[4]许惠惠,朱海燕,章彤彤,等.高危型人乳头状瘤病毒感染在宫颈病变进展中的风险研究[J].中华实验和临床病毒学杂志, 2017,31(4):302-306. DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.006.
[5]JouraEA, GiulianoAR, IversenOE, et al. A 9-valent HPV vaccine against infection and intraepithelial neoplasia in women[J]. N Engl J Med, 2015,372(8):711-723. DOI: 10.1056/NEJMoa1405044.
[6]Mu?ozN, ManalastasR, PitisuttithumP, et al. Safety, immunogenicity, and efficacy of quadrivalent human papillomavirus (types 6, 11, 16, 18) recombinant vaccine in women aged 24-45 years: a randomised, double-blind trial[J]. Lancet, 2009,373(9679):1949-1957. DOI: 10.1016/S0140-6736(09)60691-7.
[7]YeagerMD, Aste-AmezagaM, BrownDR, et al. Neutralization of human papillomavirus (HPV) pseudovirions: a novel and efficient approach to detect and characterize HPV neutralizing antibodies[J]. Virology, 2000,278(2):570-577. DOI: 10.1006/viro.2000.0674.
[8]KawanaK, YoshikawaH, TaketaniY, et al. In vitro construction of pseudovirions of human papillomavirus type 16: incorporation of plasmid DNA into reassembled L1/L2 capsids[J]. J Virol, 1998,72(12):10298-10300.
[9]BuckCB, PastranaDV, LowyDR, et al. Generation of HPV pseudovirions using transfection and their use in neutralization assays[J]. Methods Mol Med, 2005,119:445-462. DOI: 10.1385/1-59259-982-6:445.
[10]GuY, WeiM, WangD, et al. Characterization of an Escherichia coli-derived human papillomavirus type 16 and 18 bivalent vaccine[J]. Vaccine, 2017,35(35Pt B):4637-4645.DOI: 10.1016/j.vaccine.2017.06.084.
[11]WeiMX, LiSW, HuangB, et al. [Production of human papillomavirus type 16 virus-like particles and its immunogenicity][J]. Bing Du Xue Bao, 2009,25(4):245-250.
[12]BuckCB, PastranaDV, LowyDR, et al. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors[J]. J Virol, 2004,78(2):751-757.
[13]PastranaDV, BuckCB, PangYY, et al. Reactivity of human sera in a sensitive, high-throughput pseudovirus-based papillomavirus neutralization assay for HPV16 and HPV18[J]. Virology, 2004,321(2):205-216. DOI: 10.1016/j.virol.2003.12.027.
[14]WangD, LiZ, XiaoJ, et al. Identification of Broad-Genotype HPV L2 Neutralization Site for Pan-HPV Vaccine Development by a Cross-Neutralizing Antibody[J]. PLoS One, 2015,10(4):e0123944. DOI: 10.1371/journal.pone.0123944.
[15]LiZ, WangD, GuY, et al. Crystal Structures of Two Immune Complexes Identify Determinants for Viral Infectivity and Type-Specific Neutralization of Human Papillomavirus[J]. MBio, 2017,8(5)DOI: 10.1128/mBio.00787-17.
[16]郑舟,周国栋,张雅丽,等.人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化[J].厦门大学学报(自然科学版),2009,48(2):269-273. DOI: 10.3321/j.issn:0438-0479.2009.02.026.
[17]WangJW, RodenRB. L2, the minor capsid protein of papillomavirus[J]. Virology, 2013,445(1-2):175-186. DOI: 10.1016/j.virol.2013.04.017.
[18]SehrP, RubioI, SeitzH, et al. High-throughput pseudovirion-based neutralization assay for analysis of natural and vaccine-induced antibodies against human papillomaviruses[J]. PLoS One, 2013,8(10):e75677. DOI: 10.1371/journal.pone.0075677.
[19]王大宁,刘亚静,郑清炳,等.悬浮驯化HEK-293FT细胞表达人乳头瘤病毒16型假病毒及其冷冻电镜结构解析[J].病毒学报,2016,32(5):551-559.
[20]de VilliersEM. Cross-roads in the classification of papillomaviruses[J]. Virology, 2013,445(1-2):2-10. DOI: 10.1016/j.virol.2013.04.023.
[21]ChristensenND, ReedCA, CladelNM, et al. Monoclonal antibodies to HPV-6 L1 virus-like particles identify conformational and linear neutralizing epitopes on HPV-11 in addition to type-specific epitopes on HPV-6[J]. Virology, 1996,224(2):477-486. DOI: 10.1006/viro.1996.0554.