中华预防医学杂志    2018年10期 2012—2016年天津市猩红热患儿A组链球菌病原学特征分析    PDF     文章点击量:59    
中华预防医学杂志2018年10期
中华医学会主办。
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阴杰莹 张维 杨东靖 李琳 董晓春
YinJieying,ZhangWei,YangDongjing,LiLin,DongXiaochun
2012—2016年天津市猩红热患儿A组链球菌病原学特征分析
Etiological characteristics of Streptococcus pyogenes isolated from children with scarlet fever in Tianjin from 2012 to 2016
中华预防医学杂志, 2018,52(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.10.015

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投稿日期: 2017-12-29
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2012—2016年天津市猩红热患儿A组链球菌病原学特征分析
阴杰莹 张维 杨东靖 李琳 董晓春     
阴杰莹 300011 天津市疾病预防控制中心传染病科
张维 300011 天津市疾病预防控制中心传染病科
杨东靖 300011 天津市疾病预防控制中心传染病科
李琳 300011 天津市疾病预防控制中心传染病科
董晓春 300011 天津市疾病预防控制中心传染病科
摘要: 目的  分析天津市2012—2016年猩红热患儿A组链球菌(GAS)病原学特征。方法  以2012—2016年天津市猩红热监测点医院被临床诊断为猩红热患儿为研究对象,排除标准为无法配合采样的猩红热患儿,共采集575例患儿的咽拭子。采用生化方法,对咽拭子进行细菌的分离和鉴定;采用PCR方法,对分离株进行emm基因分型和超抗原基因speAspeC检测;使用K-B纸片法测定菌株对10种抗生素的耐药性。比较不同emm基因分型GAS超抗原基因携带情况,以及所有GAS对不同抗生素耐药情况。结果  共分离得到198株GAS,检出5个emm型别,即emm1/11/12/22/89,优势型别为emm12型(52.9%,100株)和emm1型(44.4%,84株)。speAspeC基因的携带率分别为21.7%(41株)和76.7%(145株),emm1型GAS的speA基因携带率为33.3%(28株),高于emm12型[12.0%(12株)](χ2=12.21,P<0.001),emm1型GAS speAspeC基因同时携带率为27.4%(23株),高于emm12型[12.0%(12株)](χ2=7.01,P=0.008)。对阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星和氯霉素的耐药率分别为96.8%(183株)、96.3%(182株)、92.1%(174株)、92.1%(174株)、73.0%(138株)、2.1%(4株)和1.6%(3株),未发现对青霉素、头孢唑啉和万古霉素耐药,差异有统计学意义(χ2=953.28,P<0.001)。结论  emm12和emm1型GAS是导致天津市儿童发生猩红热的2个优势型别,其携带speAspeC基因情况不同;GAS对青霉素、头孢唑林和万古霉素敏感,对克林霉素、克拉霉素、红霉素和阿奇霉素高度耐药。
关键词 :猩红热;链球菌属;病原学特征
Etiological characteristics of Streptococcus pyogenes isolated from children with scarlet fever in Tianjin from 2012 to 2016
YinJieying,ZhangWei,YangDongjing,LiLin,DongXiaochun     
Department of Infectious Disease, Tianjin Center for Disease Control and Prevention, Tianjin 300011, China
Corresponding author: Yin Jieying, Email:yinjieying1981@126.com
Abstract:Objective  To investigate the etiological characteristics of Streptococcus pyogenes that caused scarlet fever from 2012 to 2016 in Tianjin.Methods  The subjects were children diagnosed clinically as scarlet fever in Tianjin scarlet fever monitoring hospital from 2012 to 2016. The exclusion criteria were children with scarlet fever who were unable to cooperate with sampling. A total of 575 cases of children's swabs were collected. Biochemical methods were used to isolate and identify the bacteria of pharynx swab, and the PCR method was used to detect the emm genotyping and superantigen speA and speC, and the resistance of the strains to 10 antibiotics was measured by K-B paper method. We compared the carrying status of superantigen genes by different types of GAS and the resistance of all GAS to different antibiotics.Results  There were 5 emm types (emm1/11/12/22/89). The dominant types were emm12 (52.9%, 100 strains) and emm1 (44.4%, 84 strains). The carrying rates of speA and speC genes were 21.7% (41 strains) and 76.7% (145 strains), respectively. The speA gene carrying rate of emm1 type GAS was 33.3% (28 strains), which were higher than that of emm12 (12% (12 strains)) (χ2=12.21, P<0.001). The speA and speC gene simultaneous carrying rate of emm1 type GAS was 27.4% (23 strains), which was higher than that of emm12 type (12% (12 strains)) (χ2=7.01, P=0.008). The percentages of the strains that were resistant to Azithromycin, Erythromycin, Clarithromycin, Clindamycin, Tetracyclin, Levofloxacin and Chloramphenicol were 96.8% (183 strains), 96.3% (182 strains), 92.1% (174 strains), 92.1% (174 strains), 73.0%(138 strains), 2.1% (4 strains) and 1.6% (3 strains), respectively. All isolates were susceptible to Penicillin, Cefazolin and Vancomycin, and there were statistical significance (χ2=953.28, P<0.001).Conclusion  The dominant emm types causing scarlet fever are emm12 and emm1. The frequencies of speA and speC in emm1 and emm12 are different. S.pyrogenes in Tianjin were susceptible to penicillin, cefazolin and vancomycin, but highly resistant to the clindamycin, clarithromycin, erythromycin and azithromycin.
Key words :Scarlet fever;Streptococcus;Etiological characteristics
全文

猩红热是A组β型溶血性链球菌(group A β-haemolytic streptococcus,GAS)引起的急性呼吸道传染病,是我国法定报告的乙类传染病,自2011年猩红热发病率明显升高,引起社会各界广泛关注。GAS还可引起急性扁桃体炎、猩红热、脓疱疮,少数患者可出现风湿热、急性肾小球肾炎等并发症,严重危害青少年身体健康[1]。链球菌超抗原具有超强的免疫刺激活性,是GAS的主要毒力因子,不同地区GAS对超抗原携带水平存在差异。GAS的emm分型是近年来国内外广泛应用的分型方法,通过emm分型可以掌握本地区GAS流行病学资料,有助于GAS疫苗的研究。目前认为青霉素是治疗猩红热的首选药物,对青霉素过敏者可应用大环内酯类抗生素进行治疗,但近年随着大环内酯类抗生素的广泛应用,耐药问题已成为全球关注的问题。为了解天津市GAS主要emm基因型、超抗原携带情况及对抗菌药物的敏感性,对猩红热患儿中分离到的GAS进行emm分型,并开展抗生素敏感性试验和超抗原基因检测,以了解其病原学特征,为指导猩红热防控工作提供科学依据。

材料与方法  

一、材料  

1.菌株来源:  以2012—2016年天津市猩红热监测点医院被临床诊断为猩红热患儿为研究对象。纳入标准:符合猩红热诊断标准[2];排除标准:无法配合采样的猩红热患儿。最终共采集575例患儿的咽拭子,尽快送至天津市疾病预防控制中心开展GAS的分离和鉴定。所有咽拭子采样工作均通过天津市疾病预防控制中心伦理委员会审查(批号:TJCDC2016002),并与患者签署知情同意书。

2.主要试剂与仪器:  VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏分析系统、GP生化卡购自法国梅里埃公司;细菌基因组提取试剂(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)、DL2000 Marker、LA Taq酶、DNATaq聚合酶和dNTP均购自TaKaRa宝生物(大连)公司;抗生素纸片购自英国OXOID公司;温度梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司;CO2培养箱购自美国Thermo公司;凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司;电泳仪购自北京市六一仪器厂。

二、方法  

1.细菌的分离和鉴定:  将咽拭子标本划线接种于琼脂平板,在37 ℃,体积分数为5%的CO2孵箱中培养18 h。次日,挑取具有β溶血可疑菌分纯后进行革兰染色,采用VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏分析系统及GP生化卡进行生化鉴定。

2.emm基因分型:  采用美国疾病预防控制中心的emm分型标准化方法进行分型(http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strp/protocol_emmtype.htm)。提取待测菌DNA后经通用引物进行PCR扩增,上游引物:5'-TATT(C/G)GCTTAGAAAATTAA-3',下游引物:5'-GCAAGTTCTTCAGCTTGTTT-3'。反应体系为100 μl,包括水82 μl,缓冲液10 μl,dNTP 2 μl,引物1、2各2 μl,DNATaq聚合酶0.5 μl,2 μl DNA模板。PCR反应条件如下:94 ℃,预变性1 min,94 ℃变性15 s,46.5 ℃退火30 s,72 ℃延伸75 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物纯化及测序均委托上海英潍捷基生物技术有限公司完成。测序序列结果与美国疾病预防控制中心网站数据库比对,实现GAS的emm分型。

3.超抗原基因检测:  采用PCR法检测GAS的2种超抗原基因speAspeC。PCR反应条件为94 ℃,预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min;30个循环后,72 ℃再延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像系统观察结果。

4.抗生素敏感性试验:  采用K-B纸片试验法进行抗生素敏感性试验。细菌分纯后,以0.5号麦氏管比浊,采用5%羊血的Mueller-Hinton琼脂培养基,涂菌后将药敏纸片贴于培养基表面,培养18 h后按照美国临床和实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[3]推荐的纸片扩散法,测定受试菌株对青霉素(penicillin,PEN)、头孢唑林(cefazolin,CFZ)、氯霉素(chloramphenicol,CHL)、红霉素(erythromycin, ERY)、阿奇霉素(azithromycin, AZM)、克拉霉素(clarithromycin, CLA)、克林霉素(clindamycin, CLI)、万古霉素(vancomycin, VA)、四环素(tetracycline,TE)和左氧氟沙星(levofloxacin, LEV)10种抗生素的抑菌环直径,并参照文献[3]推荐的标准进行抗生素敏感性的结果判定和解释。

三、统计学分析  数据录入采用Excel 2017软件,统计学分析采用SPSS 16.0软件。患儿的年龄属于正态分布,采用±s表示;采用χ2检验比较不同年份emm型别构成,不同emm型别菌株超抗原基因携带率,以及不同年份菌株抗生素耐药情况差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

一、基本情况  共分离得到198株GAS菌株,分离率为34.4%;成功扩增emm基因的菌株为189株,2012—2016年分别为86、34、15、38、16株,有9株菌株的emm基因未成功鉴定。189例分离出GAS菌株并成功扩增emm基因的患儿年龄为(6.4±2.1)岁,其中男性为122例(64.6%),女性为67例(35.4%)。

二、GAS菌株emm基因分型  189株GAS中,emm1/11/12/22/89型分别有84、1、100、2、2株。2012和2015年emm12型所占比例较高,分别为60.5%(52株)和65.8%(25株),2014和2016年emm1型占比较高,分别为11/15和10/16;2012—2016年各年emm型别构成比差异有统计学意义(χ2=36.88,P=0.002)。

三、emm优势型别菌株的超抗原基因检测  189株GAS中,携带speAspeC的菌株分别为41株(21.7%)、145株(76.7%),同时携带speAspeC的菌株为36株(19.0%),2016年GAS对speA的携带率最高,为62.5%(10株),2014年GAS对speC的携带率最高,为93.3%(14株),2014年GAS对speAspeC同时携带率最高,为40.0%(6株)。见表1emm1型GAS的speA基因的携带率高于emm12型,差异有统计学意义(χ2=12.21,P<0.001),emm1和emm12型GAS的speC基因携带率差异无统计学意义。见表2

表12012—2016年天津市189株A组链球菌携带超抗原基因speAspeC情况
表22012—2016年天津市184株emm1和emm12型A组链球菌超抗原基因携带情况比较

四、抗生素敏感性试验  189株GAS中,对AZM、ERY、CLA、CLI、TE、LEV和CHL素耐药率分别为96.8%(183株)、96.3%(182株)、92.1%(174株)、92.1%(174株)、73.0%(138株)、2.1%(4株)、1.6%(3株),未发现对PEN、CFZ和VA耐药的菌株,对不同抗生素的耐药率差异具有统计学意义(χ2=953.28,P<0.001)。2012、2014和2016年GAS对CLI、CLA、ERY和AZM耐药率均达到100%,2013年的耐药率分别为91.2%、82.4%、94.1%和97.1,2015年耐药率分别为68.4%、76.3%、86.8%和86.8%。见表3

表32012—2016年天津市189株A组链球菌对不同抗生素的耐药情况[n(%)]

讨论  M蛋白是由2条α螺旋状蛋白螺旋式盘旋成的纤维状分子,自细胞膜表面向外延伸,在GAS表面形成纤维原。M蛋白不仅是GAS的主要毒力因子,也是其血清学分型的分子基础。GAS的emm分型是近年来国内外广泛应用的分型方法,其通过扩增emm基因编码的M蛋白的N末端,经测序比对后确定M蛋白的类型。emm基因型别多达245种,一项世界范围内关于GAS emm分型的Meta分析显示,全球GAS主要emm型别有emm1、emm12、emm28、emm3和emm4[4]等,由于地理环境、生活习惯、宿主免疫水平等原因,各型别存在地理差异。本研究发现天津地区GAS主要流行型别为emm1和emm12,这与我国其他地区报道结果一致[5,6,7,8],提示目前致猩红热的GAS防制重点应为emm1和emm12型。不同年份天津市GAS的优势型别也不断变化,2012至2014年emm1型所占比例逐年升高,逐渐成为主导型别,但2015年emm12型比例超过emm1型,成为主要型别,2016年emm12型所占比例下降,emm1型重新占据主导位置,这说明天津地区主要emm型别处于一种动态变化中,这与北京研究结果一致[9]。有研究报道emm主导型别不断变化与猩红热流行趋势变化有关[10,11],天津市GAS菌株主导emm型别变化与猩红热发病率之间的相关性有待进一步长期连续的研究。
        由链球菌致热外毒素(streptococcal pyrogenic exotoxin)基因speAspeC编码的致热外毒素是引起猩红热患者充血性斑疹、杨梅舌、脱皮或脱屑的原因,speAspeC是目前研究较多的毒力因子,两者均是由噬菌体编码。本研究结果发现GAS菌株speAspeC基因的携带率均略低于北京市[12]和广东省[13],高于中国台湾地区[14]。天津市猩红热患儿GAS菌株speA基因、speC基因以及两种基因的同时携带率均高于韩国地区[15]。不同emm分型GAS携带的超抗原基因种类存在差异[16],之前有研究认为emm1型GAS speC的携带率较低,而emm12型speC携带率较高[17],本研究发现两种型别speC携带率差异无统计学意义,这与彭晓昊等[10]研究结果一致。本研究发现超抗原speA的携带率emm1型高于emm12型,emm1型GAS同时对speAspeC的携带率高于emm12型携带率,差异均有统计学意义,这与赵成松等[7]和吴双胜等[18]研究结果一致。有研究提出emm1型菌株流行强度降低可能是speA基因携带率下降的原因,天津市emm1型流行强度近5年呈现升高-下降-升高的趋势,比较近5年speA携带率,同样呈现这一趋势,为更近一步了解二者之间的关系,有必要继续开展连续监测。
        PEN一直是抗GAS感染性疾病的首选药物。近5年天津地区猩红热患儿咽拭子中分离的GAS对PEN100%敏感,同时对CFZ和VA敏感率一直保持100%,与我国其他地区报道一致[19,20,21]。ERY等大环内酯类药物和CLI抗菌药物是治疗PEN过敏患者感染的备选药物,但近年出现高水平耐药,引起世界范围内的广泛关注[22,23],本研究中GAS对AZM、ERY、CLA和CLI耐药率均在90%以上,其中2012年、2014年和2016年耐药率均达100%,这与北京[24,25]调查结果相似,但高于深圳地区[26]。研究结果表明,PEN仍然是治疗GAS感染的最有效抗生素,应为首选药物,对PEN过敏者可选用头孢菌素类抗生素替代,应注意避免选用ERY等大环内酯类和CLI进行治疗,以减少临床治疗失败及并发症的发生。

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