中华预防医学杂志    2018年10期 福氏志贺菌历史菌株血清型转换的分子特征研究    PDF     文章点击量:55    
中华预防医学杂志2018年10期
中华医学会主办。
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徐潇 石继春 王春娥 梁丽 郑锐 李康 黄洋 陈翠萍 叶强 阚飙
XuXiao,ShiJichun,WangChune,LiangLi,ZhengRui,LiKang,HuangYang,ChenCuiping,YeQiang,KanBiao
福氏志贺菌历史菌株血清型转换的分子特征研究
Study on the mechanism of serotype conversion of historical isolates of Shigella flexneri
中华预防医学杂志, 2018,52(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.10.016

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投稿日期: 2018-05-30
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福氏志贺菌历史菌株血清型转换的分子特征研究
徐潇 石继春 王春娥 梁丽 郑锐 李康 黄洋 陈翠萍 叶强 阚飙     
徐潇 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
石继春 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
王春娥 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
梁丽 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
郑锐 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
李康 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
黄洋 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
陈翠萍 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
叶强 102629 北京,中国食品药品检定研究院生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心
阚飙 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要: 目的  研究1949—1965年间出现血清型转换的福氏志贺菌的分子特征。方法  255株福氏志贺菌均来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)。其中,进行血清型转换研究的20株福氏志贺菌收集自1949—1965年,分别来源于中国12株、苏联3株、捷克斯洛伐克1株、美国2株、匈牙利1株、法国1株。分别使用玻片凝集和多重PCR法进行血清分型,并进行gtrⅡ基因检测。对出现血清型转换的菌株进行gtrⅡ基因序列比对以及PFGE分型。结果  255株福氏志贺菌中,79株携带gtrⅡ基因;其中19株玻片凝集为Y血清型菌株,多重PCR法检测分别为福氏2a血清型;1株玻片凝集为X血清型,多重PCR法检测为2b血清型;20株菌株发现了血清型转换,并出现了多处位点的核酸突变,除3株菌出现了3个氨基酸突变外,其余17株菌氨基酸序列均提前出现了终止密码子,导致gtrⅡ功能性失活。PFGE分析发现,携带gtrⅡ基因的Y血清型菌株与2a血清型菌株相似性为75.8%~100%,携带gtrⅡ基因的X血清型菌株与2b血清型菌株相似性为81.6%~100%。结论  发生血清型转换的福氏Y或X血清型菌株,gtrⅡ基因出现的突变更加复杂;发生血清型转换的福氏Y或X血清型菌株可能来源于福氏2a或2b血清型,并将血清型转换出现的时间向前推进至1949年。
关键词 :志贺菌,弗氏;血清分型;血清型转换;基因突变
Study on the mechanism of serotype conversion of historical isolates of Shigella flexneri
XuXiao,ShiJichun,WangChune,LiangLi,ZhengRui,LiKang,HuangYang,ChenCuiping,YeQiang,KanBiao     
National Center for Medical Culture Collections, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China
Corresponding author: Ye Qiang, Email: qiangyee@nifdc.org.cn
Abstract:Objective  The serotype screening of Shigella flexneri from 1934 to 1965 preserved by the National Center for Medical Culture Collections was carried out, and the molecular characteristics of the serotype conversion strains were studied.Methods  Serotyping of Shigella flexneri in this study was conducted by slide agglutination and multiplex PCR, respectively. The gtrⅡ gene sequence alignment and pulsed field gel electrophoresis typing were performed on the serotype conversion strains.Results  Among the 255 strains of Shigella flexneri preserved in CMCC (B) from 1934 to 1965, 79 were carrying gtrⅡ gene, of which 19 strains and 1 strain were agglutinated with the Y serotype and X serotype, respectively, and furthermore, the multiplex PCR assays results showed serotypes 2a and 2b, respectively, and the strains were considered to have serotype conversion. The 20 strains carrying the gtrⅡ gene showed multiple nucleotide mutations. Besides 3 strains of 3 amino acid mutations, the amino acid sequences of the other 17 strains showed a stop codon in advance, resulting in functional inactivation of gtrⅡ. PFGE analysis revealed that the similarity between the serotype Y strain carrying the gtrⅡ gene and the serotype 2a strain was 75.8%-100%, and the similarity between the serotype X strain carrying the gtrⅡ gene and the serotype 2b strain was 81.6%-100%.Conclusion  Mutations in the gtrⅡ gene are more complicated in serotype-transforming Shigella flexneri serotype Y or X strains. Molecular typing suggests that the serotype-transforming Shigella flexneri serotype Y or X strains may be derived from the Shigella flexneri serotype 2a or 2b, and advance the serotype conversion to 1949.
Key words :Shigella flexneri;Serotyping;Serotype conversion;Gene mutation
全文

志贺菌是导致细菌性痢疾的主要病原体,全世界范围内,造成每年约8 000万至1.65亿病例[1]。其中,福氏志贺菌则是发展中国家引起细菌性痢疾的主要血清群[2,3],特别是在我国,20世纪90年代,细菌性痢疾病例中约86%是由福氏志贺菌引起,其中又以2a血清型为主,占80%[4,5,6]。根据2010—2014年对我国感染性腹泻病原流行特征的调查研究发现,在志贺菌引起的感染性腹泻病例中,约67%是由福氏志贺菌引起的[7],有些地区更是超过了90%[8]
        福氏志贺菌的O-抗原是表面抗原,根据其结构的差异,目前可以将福氏志贺菌至少分为20种血清型,分别是1a、1b、1c、1d、2a、2b、2variant、3a、3b、4a、4av、4b、5a、5b、Y、Yv、X、Xv、6和7b等[9,10,11,12,13]。除6型之外的其他血清型,其O-抗原具有相同的四糖骨架重复单元:1个N-乙酰葡萄糖胺和3个鼠李糖。四糖骨架中特定糖的糖基化和/或乙酰化和/或磷酸乙醇胺化修饰决定了福氏志贺菌的型和群特异性抗原决定簇,形成了血清型的多样性[9,14]。而噬菌体介导的O-抗原的糖基化和乙酰化修饰,可以引起血清型转换[15]。噬菌体SfⅡ,在进行O-抗原修饰时,由gtrAgtrBgtrⅡ组成的基因簇发挥作用,其中,gtrAgtrB基因高度保守,主要参与将葡萄糖基残基从尿苷二磷酸-葡萄糖,转移至膜结合的载体脂质;gtrⅡ基因是SfⅡ噬菌体特有的,编码血清型特异性葡萄糖基转移酶GtrⅡ,在血清转换中发挥关键作用,可将葡萄糖残基从载体脂质转移到O-抗原四糖重复单位的特定糖基上,从而导致福氏Y/X血清型福氏志贺菌在感染SfⅡ后,血清型转换为2a/2b[16,17]
        在细菌进化过程中,为了逃逸宿主免疫识别,血清型转换不会仅仅出现一次。经噬菌体SfⅡ感染后由福氏Y/X转换为福氏2a/2b血清型的菌株,若gtrⅡ基因出现功能性失活,导致其无法正常发挥作用,表现为Ⅱ型抗血清凝集为阴性,则血清型又转换为福氏Y/X。gtrⅡ基因突变导致的功能失活,与噬菌体、质粒介导的血清型转换一样,是细菌在生存、进化过程中的一种策略。为深入了解福氏志贺菌血清型转换及其机制,本研究对中国医学细菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections, CMCC)保藏的福氏志贺菌进行了相关研究。

材料与方法  

一、材料  

1.菌株:  本研究中福氏志贺菌共255株,均来源于CMCC,所有菌株均经生化鉴定为志贺菌属。其中,进行血清型转换的20株福氏志贺菌收集自1949—1965年,分别来源于中国12株、苏联3株、捷克斯洛伐克1株、美国2株、匈牙利1株、法国1株。

2.试剂与仪器:  志贺菌抗血清购自日本生研公司;DNA提取试剂盒Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit购自德国Qiagen公司;相关引物合成由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成;序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司和宝日医生物技术(北京)有限公司完成;高保真PCR酶、Taq酶、DL2000 Marker、pMD 19-T载体、DNAA-Tailing Kit、E.coli HB101感受态细胞均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;琼脂糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司;SeaKem Gold Agarose琼脂糖、GelRed染色液购自北京科奥明生物技术有限公司;LB培养基购自BD公司;PCR扩增仪C1000、凝胶成像仪、凝胶电泳系统CHEF DR Ⅲ购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司;培养箱购自中仪国科(北京)科技有限公司;BioNumerics软件(7.6版本)购自比利时Applied Maths公司。

二、方法  

1.玻片凝集法:  参照说明书进行操作,诊断血清1~2滴于洁净载玻片上,用接种环取少量过夜培养的新鲜菌苔与血清轻轻研磨混匀,1 min内出现明显凝集现象为阳性结果,呈均匀浑浊现象为阴性结果,同时以生理盐水作为空白对照。对于未出现明显凝集的部分菌株,用3 ml生理盐水重悬菌液,121 ℃ 15 min高压后,900×g离心20 min,弃上清,使用200 μl生理盐水重悬菌沉淀后,参照上述步骤进行玻片凝集。

2.多重PCR法:  用试剂盒提取菌株DNA。参照文献进行多重PCR扩增[18],每个引物的终浓度为0.2 μmol/L进行混合,DNA模板使用3 μl,扩增体系为50 μl,PCR反应条件为:95 ℃ 15 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 90 s,72 ℃ 60 s,进行30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳成像后,进行结果判读。

3.gtrⅡ基因的扩增、测序和分析比较:  根据文献[19]设计引物,gtr Ⅱ-Seq-F(5'~3'):ATCGAGGTAACCCATGATT;gtr Ⅱ-Seq-R(5'~3'):AGCACTTACCGAAGTATGG,扩增产物能够覆盖完整的gtrⅡ基因簇。对本研究中的19株血清Y型和1株X型的菌株进行PCR扩增,使用高保真PCR酶,PCR三步法反应条件为:98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 2 min,进行30个循环。PCR扩增产物大小为1 895 bp,产物经胶回收后,克隆到pMD 19-T载体上进行序列测定,并与gtrⅡ基因参考序列(GenBank Accession No. AF021347)[16]进行比对分析。

4.PFGE方法:  根据20株存在血清型转换菌株的时间、地域,选取2a、2b、Y、X血清型福氏志贺菌共30株,参照PulseNet的PFGE标准方法进行。PFGE分型所用标准菌株为Salmonella Braenderup全球参考菌株H9812(CMCC(B)50983),来源于CMCC。使用Not Ⅰ限制性内切酶对福氏志贺菌进行酶切,电泳在1% SeaKem Gold Agarose琼脂糖上进行,起始脉冲时间5 s,终止脉冲时间35 s,电泳时间19 h。电泳后,经GelRed染色后在凝胶成像系统中成像。PFGE图像使用BioNumerics 7.6版本软件(Applied Maths,Belgium)进行处理,识别图像条带,并进行聚类分析,聚类图类型运用非加权配对数学平均法构建,采用Dice系数衡量PFGE带型之间的相似度。

结果  

一、玻片凝集法和多重PCR法血清分型不一致菌株特征  255株福氏志贺菌中,有79株菌携带gtrⅡ基因,其中20株菌的血清玻片凝集结果与多重PCR血清分型结果不一致:19株玻片凝集为福氏Y血清型的菌株,多重PCR血清分型结果为福氏2a血清型;有1株[菌株编号:CMCC(B)51109]玻片凝集为福氏X血清型的菌株,多重PCR血清分型结果为福氏2b血清型。20株菌的gtrⅡ基因(1 272 bp)扩增均为阳性,但是Ⅱ型抗血清凝集均为阴性;CMCC(B)51109菌株的gtrX基因(425 bp)扩增为阳性,除与7(8)群抗血清凝集外,不与任何其他抗血清凝集,表现为福氏X血清型。见表1

表120株福氏志贺菌基本信息、玻片凝集和多重PCR结果及gtrⅡ基因突变情况

二、gtrⅡ基因突变情况  20株菌株的gtrⅡ基因均出现有不同程度的核酸突变,且氨基酸序列也有改变。CMCC(B)51175、CMCC(B)51309和CMCC(B)51409菌株均存在3个氨基酸突变,分别是274位异亮氨酸(Isoleucine,Ile)/甲硫氨酸(DL-Methionine,Met),394位组氨酸(histidine,His)/酪氨酸(tyrosine,Tyr),433位谷氨酸(glutamic acid,Glu)/甘氨酸(Glycine,Gly),CMCC(B)51626菌株除了这3个氨基酸突变位点外,7位苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)/亮氨酸(Leucine,Leu);CMCC(B)51559、CMCC(B)51349和CMCC(B)51436菌株在246位氨基酸出现终止密码子;CMCC(B)51109、CMCC(B)51556、CMCC(B)51563、CMCC(B)51565、CMCC(B)51567和CMCC(B)51561菌株在359位氨基酸出现终止密码子;CMCC(B)51581菌株在406位氨基酸出现终止密码子;CMCC(B)51560、CMCC(B)51327和CMCC(B)51509菌株在423位氨基酸出现终止密码子;CMCC(B)51176菌株在424位氨基酸出现终止密码子;CMCC(B)51108、CMCC(B)51569菌株在425位氨基酸出现终止密码子。CMCC(B)51556、CMCC(B)51563、CMCC(B)51565、CMCC(B)51567、CMCC(B)51561、CMCC(B)51581、CMCC(B)51560、CMCC(B)51327、CMCC(B)51509和CMCC(B)51176菌株,在终止密码子出现前第274位也出现了氨基酸突变:lle/Met。不同年代、不同地区的福氏志贺菌Y和X血清型菌株,在gtrⅡ基因上出现的突变位置、数量以及氨基酸的改变,均有所不同,表现出福氏Y/X血清型转换机制的多样性。详见表1

三、PFGE聚类分析  50株菌株,共分为37个带型。CMCC(B)51560、CMCC(B)51563和CMCC(B)51626 Y血清型菌株(携带gtrⅡ基因)与CMCC(B)51544 2a血清型菌株具有相同的带型,并且CMCC(B)51560、CMCC(B)51563和CMCC(B)51544菌株均分离自1964年中国四川省。CMCC(B)51561和CMCC(B)51565、CMCC(B)51567和CMCC(B)51569、CMCC(B)51349和CMCC(B)51436菌株,均携带gtrⅡ基因的Y血清型菌株分别具有相同的带型。CMCC(B)51175、CMCC(B)51409、CMCC(B)51176、CMCC(B)51309和CMCC(B)51509来源于国外的福氏Y血清型菌株(携带gtrⅡ基因),与本研究中其余菌株相似性最低,仅有60.56%。CMCC(B)51109 X血清型菌株(携带gtrⅡ基因)和CMCC(B)51100 2b血清型菌株具有相同的带型,且和其余的2b血清型菌株的带型相近。全部2b、X血清型菌株(共12株)聚类在一起,与另外所有2a、Y血清型菌株(38株)相似性低,最高为69.2%。详见图1

图1携带gtrⅡ基因的Y和X血清型福氏志贺菌的PFGE带型与2a、2b、X、Y血清型菌株的聚类关系

讨论  由噬菌体介导的O-抗原糖基化和乙酰化修饰,是福氏志贺菌血清型转换的一种途径,可介导福氏Y血清型转换为1a、2a、3b、4a、5a和X[11, 16, 20,21,22]。除Sf6是通过oac基因进行O-抗原的乙酰化修饰外[23],其余噬菌体均通过gtr(type)来进行O-抗原修饰,将葡萄糖残基连接到O-抗原四糖重复单位的特定糖基上[16, 24,25]
        本实验室对大量历史菌株进行了血清分型筛选,发现79株携带gtrⅡ基因。本研究结果发现,20株福氏志贺菌均感染过噬菌体SfⅡ,同时在gtrⅡ基因中发现了核酸突变,这可能是菌株在生存、进化过程中,由于各种压力而导致或随机出现的基因突变现象,部分出现在了gtrⅡ基因上。这些突变,导致氨基酸序列提前出现了终止密码子,或多处的氨基酸序列发生改变,引起功能性突变,最终出现了血清型转换的现象。既往研究也出现过类似的血清型转换情况,gtrⅠ基因由于单碱基的缺失,导致其发生功能性失活,使福氏1a血清型突变回复到福氏Y血清型[26]gtrⅡ基因437位氨基酸的改变导致福氏2a转换为福氏Y血清型[17]gtrⅡ基因上发现IS1插入元件,导致血清转换的事件等[27]。但是,本研究中出现的核酸突变位点更复杂,不仅导致氨基酸序列提前出现终止密码子,且同时存在氨基酸序列突变而引起的功能性改变,这些是既往研究中未发现的。同时,本研究中关于福氏X血清型转换的研究,尚属国内、外首次报道。
        PFGE分型是细菌基因分型的"金标准",广泛应用于细菌遗传进化特征的研究中[28,29]。本研究结果发现,携带gtrⅡ基因的福氏Y血清型,与福氏2a血清型相似性更高;携带gtrⅡ基因的福氏X血清型,与福氏2b血清型相似性更高,进一步表明这些福氏Y或X血清型菌株可能来源于福氏2a或2b血清型。此外,有5株来源于二十世纪五六十年代的欧洲和北美洲的福氏Y血清型(携带gtrⅡ基因)菌株,与其余菌株的相似性只有60.56%,远离其余的菌株,推测这5株菌在进化过程中,还发生了其他的改变。
        本研究中的福氏志贺菌,收集自1949—1965年间的亚洲、欧洲和北美洲,相较其他学者的研究[17, 26,27],菌株的年代更久远,地域分布更广泛,血清转换机制更复杂,gtrⅡ基因突变位点出现的位置、数量更丰富,导致的氨基酸序列改变和密码终止子的出现更具代表性。本研究结果发现了能够引起血清型转换的更多突变类型,丰富了福氏志贺菌血清转换机制的生物多样性,将福氏志贺菌血清型转换出现的时间,又进一步向前推进至1949年,为福氏志贺菌的血清转换和进化研究提供了重要的基础。
        此外,本研究结果也提示,在进行血清分型时,使用多重PCR等高通量分子生物学方法,需要关注血清型转换的问题,多重PCR方法并不能区分血清型特异基因上出现的突变。因此在建立此类方法时,要充分考虑菌株发生变异的可能性。福氏志贺菌血清型转换现象的出现,是细菌在进化过程中的一种生存策略,这种广泛存在、且具有多样性的血清型转换,对于传染病预防控制来说,更值得我们关注。

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