中华预防医学杂志    2018年11期 2017年河南省登革热疑似病例的实验室诊断与分子溯源    PDF     文章点击量:98    
中华预防医学杂志2018年11期
中华医学会主办。
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杜燕华 李懿 王若琳 王海峰 苏佳 许汴利 黄学勇
DuYanhua,LiYi,WangRuolin,WangHaifeng,SuJia,XuBianli,HuangXueyong
2017年河南省登革热疑似病例的实验室诊断与分子溯源
Laboratory diagnosis and molecular tracing of dengue bordline cases in Henan Province, 2017
中华预防医学杂志, 2018,52(11)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.11.013

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投稿日期: 2018-01-21
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2017年河南省登革热疑似病例的实验室诊断与分子溯源
杜燕华 李懿 王若琳 王海峰 苏佳 许汴利 黄学勇     
杜燕华 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省医学病原生物学重点实验室
李懿 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省医学病原生物学重点实验室
王若琳 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省医学病原生物学重点实验室
王海峰 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省医学病原生物学重点实验室
苏佳 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省医学病原生物学重点实验室
许汴利 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省医学病原生物学重点实验室
黄学勇 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省医学病原生物学重点实验室
摘要: 目的  对2017年河南省报告的登革热疑似病例进行实验室确诊,从分子水平追踪其来源。方法  血液标本(3~5 ml)来源于2017年河南省传染病监测网络直报系统中上报的8例登革热疑似病例,按照《全国登革热监测方案》对病例进行个案调查。血液样本分离血清后,通过检测血清中登革病毒非结构蛋白1抗原(NS1)、IgM和IgG抗体以及病毒RNA进行实验室确诊;对于登革病毒RNA检测阳性的样本进行荧光PCR分型诊断和E基因序列扩增,阳性扩增产物测序后进行同源性比对。结果  8个登革热疑似病例中6例确诊为登革热实验室诊断病例,均为境外输入;其中5例病例登革病毒RNA检测阳性,经分型检测发现,登革病毒1型为1例,2型和3型各2例;对1例登革病毒2型和1例3型病例成功进行了分子溯源,其中由巴基斯坦输入的登革病毒2型病例核酸序列属于cosmopolitan基因型,与巴基斯坦2013年登革病毒2型KJ010186一致性最高,为99.0%;由马来西亚输入的登革病毒3型病例核酸序列属于Ⅰ型基因型,与2014年新加坡登革病毒3型KX224276一致性最高,为99.0%。结论  2017年河南省登革热病例经实验室诊断和分子溯源证实均为输入性病例,未引起本地流行。
关键词 :登革病毒;基因型;诊断;分子溯源;系统进化分析
Laboratory diagnosis and molecular tracing of dengue bordline cases in Henan Province, 2017
DuYanhua,LiYi,WangRuolin,WangHaifeng,SuJia,XuBianli,HuangXueyong     
Henan Center for Disease Control and Prevention, Institute of Infectious Disease Prevention and Control, Henan Key Laboratory of Pathogenic Microorganisms, Zhengzhou 450016, China
Corresponding author: Huang Xueyong, Email: Hyxzzu@163.com
Abstract:Objective  To confirm the laboratory diagnosis of dengue bordline cases reported in Henan Province and trace its origin from molecular level in 2017.Methods  The study samples were blood samples (3-5 ml), which came from 8 suspected cases of dengue fever reported in the 2017 direct reporting system of Henan provincial infectious disease monitoring network. Meanwhile, case investigation was conducted according to National dengue fever surveillance programme. Serum were separated from blood samples and tested for Dengue NS1 antigen, IgM & IgG antibodies, and dengue RNA. According to dengue diagnosis criteria, confirmed cases were identified by testing results. Samples carried dengue RNA performed for real-time PCR genotyping and amplification of E gene. Then, the amplicons were sequenced and homological and phylogenetic analyses were constructed.Results  8 serum samples of suspected dengue cases were collected in Henan Province, 2017. Six of them were diagnosed as dengue confirmed cases. All the dengue confirmed cases belonged to outside imported cases, 5 of them were positive by dengue RNA testing. Genotyping results showed there were 1 DENV1 case, 2 DENV2 cases and 2 DENV3 cases. A DENV2 case and a DENV3 case of this study were traced its origin successfully. The sequence of Pakistan imported DENV2 case belongs to cosmopolitan genotype, which was the most consistent with Pakistan's DENV2 KJ010186 in 2013 (identity 99.0%). The sequence of Malaysia imported DENV3 case belongs to genotype I, which was the most consistent with Singapore's DENV3 KX224276 in 2014(identity 99.0%).Conclusion  The laboratory diagnosis and molecular traceability of dengue cases in Henan Province in 2017 confirmed that all cases were imported and did not cause local epidemics.
Key words :Dengue virus;Genotype;Diagnosis;Molecular tracing;Phylogenetic analysis
全文

在过去的50年间,登革热的发病率增加了30倍,目前在热带、亚热带地区已有超过100个国家和地区曾发生过该病的地方性流行,如今登革热已成为全球性的严重公共卫生问题[1]。在中国,登革热疫情呈明显上升趋势,主要为输入性散发病例报告或输入引起的本地传播[2,3]。2013年,在河南省禹州市首次报告了由输入病例引起的温带地区登革热本地流行[4];2014年广东省近4万登革热报告病例,出现了我国历史上规模最大的一次登革热暴发疫情,造成重大的疾病负担[5]。由于现今人群流动性强,尤其对于输入性病例很难辨别其传染源,而实验室检测在短时间内只能给出诊断结果,这些都会给寻找真正的传染源(输入性病例),并遏制其造成进一步传播到来的困难。本研究通过对2017年河南省登革热的实验室诊断和溯源研究,从而了解其基因分布特征及其传播来源,可以及时发现登革热疫情,严防输入传播,预防控制登革热续发病例,避免出现较大暴发或流行,减轻登革热的危害。

材料和方法  

1.标本来源:  血液标本(3~5 ml)来源于2017年河南省传染病监测网络直报系统中上报的8例登革热病例;按照《全国登革热监测方案》对病例进行个案调查,调查内容包括:病例个人信息、发病情况、症状和体征、一般实验室检查、病原学检测、病例分类、既往史、接触史和有关因素调查。登革热确诊病例诊断标准:参照《登革热诊疗指南(2014年版)》[6]中的诊断标准,确诊病例为疑似或临床诊断病例急性期血清中,检测出非结构蛋白1抗原(non-structural protein,NS1)或病毒核酸,或分离出登革病毒或恢复期血清特异性IgG抗体阳转或滴度呈4倍以上升高。

2.NS1抗原检测:  采用胶体金NS1抗原快速检测试剂盒(One Step Dengue NS1 RapiDipTM InstaTest,购自美国Cortez公司),按照试剂盒说明书,取病例血清标本检测登革热NS1抗原。

3.登革热血清抗体检测:  采用登革热胶体金免疫层析试剂(澳大利亚Panbio公司),取病例血清标本按说明书方法检测登革热IgM和IgG抗体。

4.核酸提取与荧光PCR检测:  取病例血清标本140 μl,用病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit,购自德国Qiagen公司),按说明书进行操作,最终收集60 μl的RNA提取液。用荧光PCR法登革病毒通用型核酸检测试剂盒(硕世生物科技有限公司),检测病例血清中提取的RNA。若检测结果为阳性,再用荧光PCR法登革病毒1、2、3和4型核酸检测试剂盒(江苏硕世生物科技有限公司)进行分型检测。

5.E基因的扩增及序列测定:  参考文献[7]中方法,分别合成可扩增登革病毒4个血清型E基因的特异性引物序列。根据登革热荧光PCR分型结果,选择相应血清型E基因特异性引物,采用一步法RT-PCR Kit试剂盒(德国Qiagen公司)进行扩增,RT-PCR循环条件如下:50 ℃逆转录30 min,95 ℃灭活酶及预变性15 min;94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s;扩增40个循环,72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,阳性扩增产物送南京金斯瑞生物科技公司测序。

6.同源性分析与系统发生树的构建:  将测序获得的基因序列用DNAstar软件SeqMan模块进行拼接,利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中BLAST模块(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性检索,搜索并下载登革热不同基因亚型代表株序列,利用ClustalX软件进行比对,用Bioedit软件剪切后进行同源性分析,最后采用MEGA 5.0软件用最大简约法(maximum parsimony methods,MP)构建进化树,分析采用1 000个多序列组(replicates)。

结果  

1.实验室诊断情况:  2017年河南省报告的8例登革热疑似病例,实验室检测结果见表1。除6和7号病例外,其余6例疑似病例确诊为登革热病例。其中,1、3、4、5和8号病例的标本为NS1抗原和登革病毒通用型核酸阳性,1、3和8号病例的标本为IgM抗体阳性、IgG抗体阴性,确定1、3、4、5和8号病例为实验室确诊病例;2号病例的标本采集时间距发病时间间隔较长,IgM抗体阴性、IgG抗体阳性,而此病例在从菲律宾回中国时,经广州市检测登革热核酸为阳性,因此病例也可确诊为登革热实验室诊断阳性病例。

表12017年河南省8例疑似登革热病例基本情况及实验室检测结果

2.实验室确诊病例血清型分型:  6例实验室确诊病例中,5例登革病毒通用型核酸阳性,登革病毒分型检测结果显示,登革病毒1型为1例,2型为2例,3型为2例。见表1

3.E基因的扩增和序列分析:  1号病例登革病毒2型引物扩增结果为阳性,5号病例登革病毒3型引物扩增结果为阳性,3、4和8号相应型别引物扩增均为阴性。对1和5号病例E基因的阳性扩增产物进行测序,将序列递交NCBI Genbank数据库,并命名为HN201701和HN201705,获得序列号分别为MG778910和MG778911。通过核酸同源性比对,HN201701与2013年巴基斯坦2型登革病毒KJ010186一致性最高,为99.0%;HN201705与2014年新加坡3型登革病毒KX224276一致性最高,为99.0%。

4.系统进化树分析:  2017年河南省HN201701序列与25株登革病毒2型的6个基因型序列构建系统进化树,分析结果显示属于cosmopolitan基因型,与巴基斯坦2型登革病毒KJ010186(2013年)、KF041234(2011年)、KF041237(2009年)进化关系较近,而此病例流行病学调查也证实该病例为巴基斯坦输入。HN201705与27株登革病毒3型的5个基因型序列构建系统进化树,分析结果显示属于Ⅰ型,与新加坡3型登革病毒KX224276(2014年)、JN380808(2009年)、KY921906(2015年)进化关系较近此病例是马来西亚输入,马来西亚与新加坡毗邻,此输入病例来源分子溯源结果与流行病学调查结果基本一致。

讨论  登革热是由黄病毒科黄病毒属登革病毒引起的一种分布广、发病多、危害较大的急性蚊媒传染病[8,9]。河南省位于我国中部,属于温带地区,2013年9月首次暴发登革热由输入性病例引发的本地疫情,是全球暴发登革热本地疫情纬度最高的1次,而该地区既往病例均为散发输入性病例,因而引起了世界范围内的广泛关注[10,11]。在该暴发疫情的初期并未怀疑是登革热,而作为不明原因疾病对待,因此错过了采取防控措施的最佳时期。汲取过去的经验教训,在2017年登革热监测中加快了病例实验室确诊时间并优化检测流程,并对2例确诊病例完成了分子溯源,结合流行病学调查,采取了响应的防控措施,2017年河南省未发生本地登革疫情。本研究获得的分子溯源结果与传统流行病学调查结合起来可得出更为准确的流行病学结论。在登革热病例输入后,实验室确诊和分子溯源的时效性和准确性,与操作者的技术水平和前期工作积累程度相关。加强病例分子溯源的研究,快速准确的推测输入病例毒株来源,搞清传播链,可为疫情分级与响应,流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供重要的科学依据。
        登革热疑似或临床病例的实验室确诊,其准确性和时效性对于疫情处置至关重要,而实验室诊断方法的选择与实验条件、试剂与技术储备、发病与采样时间间隔等多因素有关。目前实验室常用的检测方法是荧光PCR或RT-PCR法、NS1抗原检测、登革病毒特异性IgM和IgG抗体检测以及病毒分离培养。NS1抗原是登革病毒非结构蛋白中唯一的糖蛋白,其大量存在于感染细胞的表面,无论初次或是二次感染登革病毒,人体内均出现NS1抗原的病毒代谢产物,可作为早期诊断的特异性指标,一般在发病后6 d内检出率高[12,13]。《登革热诊疗指南(2014年版)》[6]中的诊断标准就增加了NS1抗原检测方法作为急性期患者确诊方法。本次研究也发现疑似登革热病例急性期血清NS1抗原检测结果与荧光PCR检测结果完全一致。而NS1抗原检测方法操作简单,设备要求低,特别适合基层医疗卫生机构作为快速诊断或筛查的方法。荧光PCR法是目前大多数病毒性疾病实验室确诊的方法,敏感度和特异性都比较高,登革病毒荧光PCR检测法不仅可以确诊病例而且能够分型[14,15]。病毒分离方法虽然可以确诊病例,但其耗时长,不适用于快速诊断。登革病毒特异性IgM和IgG抗体,IgM阳性且IgG阴性,或IgM/IgG均阳性提示患者可能新近感染。登革初次感染特点是IgM高IgG低,而二次感染特点是IgG高IgM低[16]。因此,病例确诊依赖于病程所处的时间,IgM和IgG抗体检测结果可作为辅助诊断,单份标本IgM抗体检测结果不能确诊。因此,尽可能采集发病早期的患者血清标本,根据病程选择合适的检测方法和流程,对于疑似登革热患者的确诊以及后续的疫情处置和防控至关重要。

参考文献
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