中华预防医学杂志    2018年11期 2013—2014年青岛市柯萨奇病毒B5型手足口病病原学及重症病例临床特征    PDF     文章点击量:117    
中华预防医学杂志2018年11期
中华医学会主办。
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梁荣香 史晓燕 张艳辉 苏志磊 张凤 柴青 宫金伶 汪照国
LiangRongxiang,ShiXiaoyan,ZhangYanhui,SuZhilei,ZhangFeng,ChaiQing,GongJinling,WangZhaoguo
2013—2014年青岛市柯萨奇病毒B5型手足口病病原学及重症病例临床特征
Etiology and clinical analysis of central nervous system infection caused by Coxsackievirus B5 in severe hand, foot and mouth disease in Qingdao City, 2013-2014
中华预防医学杂志, 2018,52(11)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.11.014

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投稿日期: 2018-01-29
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2013—2014年青岛市柯萨奇病毒B5型手足口病病原学及重症病例临床特征
梁荣香 史晓燕 张艳辉 苏志磊 张凤 柴青 宫金伶 汪照国     
梁荣香 266021 青岛大学公共卫生学院
史晓燕 青岛市疾病预防控制中心微生物检验科
张艳辉 青岛市妇女儿童医院感染消化科
苏志磊 青岛市疾病预防控制中心微生物检验科
张凤 青岛市疾病预防控制中心微生物检验科
柴青 青岛市疾病预防控制中心微生物检验科
宫金伶 青岛市疾病预防控制中心微生物检验科
汪照国 266021 青岛大学公共卫生学院;青岛市疾病预防控制中心微生物检验科
摘要: 目的  分析青岛市感染萨奇病毒B5(CV-B5)手足口病病例的分子特征及其所致重症病例的临床特征。方法  以2013—2014年青岛市妇女儿童医院常规监测的手足口病病例为研究对象,共1 844例,收集其咽拭子标本和脑脊液标本;采用回顾性研究的方法,收集研究对象的临床资料。对标本进行病毒核酸提取和分型鉴定;采用RT-PCR对CV-B5病毒株进行VP1基因全长扩增,并进行序列测定。采用MEGA 7.0软件进行系统进化分析及分子特征分析;并与原型株Faulkner毒株进行比较,其VP1氨基酸序列来源于GenBank数据库。结果  共获得CV-B5阳性病例8例,其中男性4例,女性4例;住院重症病例6例,门诊病例2例。6例重症住院病例的年龄为3~48月龄,中位数为26月龄,临床症状以发热、抽搐、呕吐、腹泻、皮疹为主,均合并病毒性脑炎。在VP1区,8株CV-B5病毒株与原型株核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为77.3%~78.8%和95.5%~97.0%,氨基酸有13处变异,6株分离自重症病例毒株中有5株在VP1区发生N95S变异;在VP1进化树上,8株CV-B5病毒株全部属于D基因亚型,与同期国内其他地方毒株成一簇。结论  感染CV-B5所致重症手足口病可出现神经系统受累,主要的并发症为病毒性脑炎;CV-B5毒株在VP1区核苷酸和氨基酸变异较小,呈现一定的区域聚集性。
关键词 :手足口病;中枢神经系统;柯萨奇病毒B5;临床特点
Etiology and clinical analysis of central nervous system infection caused by Coxsackievirus B5 in severe hand, foot and mouth disease in Qingdao City, 2013-2014
LiangRongxiang,ShiXiaoyan,ZhangYanhui,SuZhilei,ZhangFeng,ChaiQing,GongJinling,WangZhaoguo     
College of Public Health, Qingdao University, Qingdao 266021, China
Corresponding author: Wang Zhaoguo, Email: wzg-003@163.com
Abstract:Objective  To illuminate the gene characteristics and clinical characterization of Coxsackievirus B5 (CV-B5) strains isolated from patients with sevre hand, foot and mouth disease (HFMD) in Qingdao city.Methods  A total of 1 844 patients of HFMD were consecutively admitted to Qingdao Women and Children's Hospital from 2013 to 2014. Information of the study population described above was collected retrospectively. The samples were collected from at least 1 site (throat swab, cerebrospinal fluid), which viral nucleic acid extracted and the entire VP1 gene sequences of CV-B5 isolates were amplified and sequenced, then the homology and phylogeny analysis were conducted by MEGA7.0. The prototype Faulkner strain and other VP1 amino acid sequences were derived from the GenBank database.Results  A total of 8 CV-B5 positive cases were obtained, including 4 males and 4 females; 6 severe hospitalized cases and 2 outpatients. The age of 6 hospitalized patients ranged from 3 to 48 months, with a median of 26 months. For the six inpatients, fever, convulsions vomiting, diarrhea and rash were the main clinical manifestation, and all combined with viral encephalitis. Compared with the prototype strain Faulkner, in the VP1 region,the nucleotide and the amino acid homologies was 77.3%-78.8% and 95.5%-97.0% respectively. Five out of the six severe cases with substitution of serine (S) to asparagine (N) at amino acid site 95 in the VP1 region. The sequences of 8 CV-B5 strains were classified into genogroup D.Conclusion  Hand, foot and mouth disease associated with CV-B5 virus infection can result in nervous system involvement and the main complication was viral encephalitis. The CV-B5 strains associated with severe hand, foot and mouth disease had high nucleotide homology and present a certain regional aggregation.
Key words :Hand, foot and mouth disease;Central nervous system;Coxsackievirus B5;Clinical characterization
全文

人类肠道病毒(human enterovirus,EV)属于小RNA病毒科肠道病毒属,包括脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)A和B组及新型肠道病毒,基于病毒多基因组区域的系统发育关系,将其分为A、B、C、D四个种群,CV-B组肠道病毒属于B种群,包含6个血清型:CV-B1~CV-B6,其中CV-B5是引起人弛缓性麻痹、无菌性脑膜炎散发或暴发流行的一种重要病原[1,2,3,4,5,6]。尽管有研究表明CV-B5在手足口病病原谱构成中占一定的比例,且有CV-B5感染手足口病伴有神经系统表现的报道[7,8],但目前针对手足口病相关CV-B5分子特征及临床特征的研究仍相对较少。因此,本研究对2013—2014年青岛市手足口病病原学监测中分离到的8个CV-B5病毒VP1区分子特征及其中6个CV-B5相关重症病例临床特征进行分析,以了解青岛地区流行的手足口病相关CV-B5的遗传学背景,临床特征,为CV-B5的预防控制及临床救治提供一定的科学依据。

材料与方法  

1.毒株来源:  以2013—2014年青岛市妇女儿童医院常规监测的手足口病病例为研究对象,共1 844例,手足口病的诊断标准参照原卫生部发布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》[9]。收集手足口病病例的咽拭子标本和脑脊液标本。本研究经过青岛市疾病预防控制中心医学伦理委员会审核批准(批号:201411),病例标本采集和临床资料收集均征得病例家属的知情同意。

2.临床资料收集:  采用回顾性研究的方法,通过青岛市妇女儿童医院电子病历系统,对病例进行临床资料收集;资料收集包括基本人口统计学信息、临床症状、体征、实验室检查、影像学检查、治疗和预后等信息。

3.核酸提取及型别鉴定:  采用德国罗氏公司生产的核酸提取试剂盒(MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit),经MagNA Pure LC 2.0自动核酸提取仪提取病毒RNA,采用上海之江生物技术有限公司生产的荧光RT-PCR核酸检测试剂盒在罗氏LC480荧光定量PCR仪上检测标本中的总EV,并对EV阳性样本进行EV-A71型及CV-A16型分型检测。

4.CV-B5 VP1基因扩增及序列测定:  利用B种群肠道病毒VP1基因通用引物,采用美国Promega公司生产的Access RT-PCR System Kit对EV阳性、非EV-A71、非CV-A16型的样本进行CV-B5分型检测及VP1区序列扩增。引物序列及扩增条件见文献[10]。反应条件:42 ℃ 45 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 80 s,40个循环;72 ℃ 7 min。引物合成和测序由华大基因生物公司完成。

5.CV-B5 VP1基因进化分析及氨基酸变异分析:  应用Sequencher软件进行序列拼接以获得VP1全长,应用Mega 7.0软件进行序列比对及同源性分析,并对其进行系统发育进化分析,选取GenBank中39个CV-B5代表株VP1全长序列与青岛地区获得的CV-B5 VP1全长序列共同构建基因进化树,系统进化树的绘制采用Neighboring-joining方法及Kimura-2-Parameter模式进行,Bootstrap值进行1 000次重复运算。根据系统发育树上显示出的分支关系,以核苷酸序列约15%的差异作为划分不同基因型的标准,将所有CV-B5序列划分为不同的基因型。使用MEGA 7. 0软件分别计算不同基因型间的组间平均进化距离和核苷酸序列相似性。CV-B5 VP1基因编码氨基酸同源性与原型株Faulkner毒株进行比较,其VP1氨基酸序列来源于美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)GenBank数据库。

6.统计学分析:  采用Excel 2016对数据进行整理和分析。研究对象年龄、发病到住院间隔时间、住院时间不符合正态分布,采用中位数表示。

结果  

1.基本情况:  共获得CV-B5阳性病例8例,其中男性4例,女性4例;住院重症病例6例(2013年1例,2014年5例),门诊病例2例(均来自2014年)。6例重症住院病例的年龄为3~48月龄,中位数为26月龄;其中男性3例,女性3例;发病时间在6~7月份,病例起病后第1~10天入院,中位数为第4天;住院时间在5~9 d,中位数为6 d。详见表1

表12013—2014年青岛市6例CV-B5阳性重症手足口病住院病例的临床特征

2.临床特征:  所有病例均无基础性疾病,以发热、抽搐、呕吐、腹泻、皮疹为主要症状。其中,高热病例(>39 ℃)为3例,中高热病例(38~39 ℃)为3例;住院后发热天数为1~5 d,中位数为4 d。见表1。6例病例均有神经系统症状,且肺纹理均增多;消化道症状中,呕吐病例为3例,腹泻病例为1例;皮疹发生在手部的为5例,足部为3例,臀部为3例,关节为1例,皮疹均为红色丘疹,口腔疱疹为1例;白细胞>10×109个/L者为4例;C反应蛋白(C reactive protein,CRP)>10 mg/L者为2例;膝反射活跃为5例,1例未引出;巴氏症阳性为5例。根据《手足口病诊疗指南(2010年版)》[9],6例重症病例均使用阿糖苷腺苷、热毒宁抗病毒治疗,甘露醇降颅压,补充钾剂,甲泼尼龙抗炎,并应用兰索拉唑保护胃黏膜等治疗,除编号14HS682病例,其他5例均应用免疫球蛋白封闭抗体阻断病情进展,治疗后均治愈出院,无后遗症。

3.VP1基因序列分析:  8株CV-B5毒株均无碱基的插入与缺失。CV-B5的VP1区全长为849 bp,G+C含量为49.45%,与原型株Faulkner毒株的核苷酸同源性是77.3%~78.8%;氨基酸同源性是95.5%~97.0%;8株CV-B5病毒株之间的核苷酸同源性为90.6%~98.9%,氨基酸同源性为98.5%~100%。

4.氨基酸变异位点分析:  与原型株Faulkner比较,在VP1区,氨基酸序列共有13处位点发生变异,其中8处氨基酸位点是8株同时变异,另外5处为部分毒株发生的变异。见表2

表22013—2014年青岛市8株CV-B5病毒株的氨基酸位点变异情况

5.系统进化分析:  根据进化树和核苷酸(氨基酸)同源性比对,将8株CV-B5毒株序列划分为4个基因亚型(A~D),各基因亚型间平均遗传距离为0.160~0.228。见表3。A基因型只包括原型株Faulkner;B基因型包括中国山东省和韩国的2株毒株,分别为SD/CHN/GQ329771和KOR/AY875692;C基因型包括在欧美多个国家流行的毒株;D基因型主要由2009年以来中国流行毒株构成,并且在其内部形成3个分支(Ⅰ~Ⅲ),2009年山东和河南省的毒株均位于分支Ⅲ,2009年以后中国其他地区毒株组成了分支Ⅰ和Ⅱ,本研究中的8株CV-B5毒株也位于这两个分支上,且有7株位于优势流行分支Ⅰ。见图1

表32013—2014年青岛市8株CV-B5病毒株各基因亚型之间VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性(%)
图12013—2014年青岛市8株CV-B5及来源于GenBank病毒参考株的VP1基因进化树

讨论  青岛市CV-B5重症手足口病病例发病年龄主要为5岁以下人群,集中于6~7月份。临床症状有发热、皮疹,伴有或不伴有白细胞和CRP的升高,所有CV-B5感染的手足口病住院病例均出现惊跳、肢体抖动、抽搐、病理征阳性或膝反射亢进等神经系统受累症状,提示CV-B5感染引起的手足口病可以合并中枢神经系统感染,与既往研究结果相一致[1,8,11]
        本研究发现,2013—2014年青岛市流行的CV-B5毒株分为2个分支,提示毒株有多个传播链在青岛市流行。青岛毒株全部属于D基因亚型,且与同期国内其他地方毒株串在一起,同源性高,表明此类毒株在中国广泛传播。2009年引起山东省[3]和河南省[12]无菌性脑膜炎暴发的分支Ⅲ样毒株自2010年以后再未被发现;青岛市CV-B5毒株有87.5%位于分支Ⅰ,与2014年四川省[4]急性弛缓性麻痹病例(acute flaccid paralysis,AFP)毒株、安阳市[6]手足口病病例毒株串在一起,位于分支Ⅱ中的青岛市毒株14HS741在系统发育树上同来源于云南省无菌性脑膜炎病例[13]及四川省AFP病例[4]毒株亲缘关系较近,由此可见,青岛市CV-B5的流行可能存在着和国内其他省份相同的传染源,进化途径相近,充分说明毒株流行在地理上和时间上的趋近性。值得注意的是位于分支Ⅰ的CV-B5毒株早在2009年河南省[14]无菌性脑膜炎暴发事件标本中就偶有分离(CB28),并不断进化,形成在中国持续流行的态势,这警示我们要加强对遗传变异株的动态监测,密切关注其流行变异。
        本研究中,CV-B5毒株VP1基因编码蛋白第80、90和91氨基酸位点发生变异,这些位点位于病毒VP1编码区的BC环上(82~93位氨基酸),与病毒的抗原性密切相关,该区域氨基酸位点发生变异,可导致相应构象的变化,可能会影响病毒与宿主细胞结合[15]。有研究表明,近年中国流行的CV-B5毒株VP1基因编码蛋白正向选择位点为第2、75、95、200、259、283位点[7],2009年郑州市无菌性脑膜炎暴发相关14例重症病例患者的CV-B5毒株在VP1区95位氨基酸均发生N95S变异,提示VP1区95位氨基酸可能是病毒的主要毒力位点[3],本研究6个重症病例CV-B5毒株中也有5个毒株在VP1区发生N95S变异,进一步印证了此观点。
        病毒性脑炎和脑膜炎是手足口病重症病例的常见表现,对患儿威胁较大,多见于EVA71的感染[16,17],本研究结果表明,CV-B5也是2013—2014年青岛市致手足口病重症病例的病原,且CV-B5感染手足口病易伴有神经系统受累症状。CV-B5引起的病毒性脑炎呈全球范围内分布,欧洲、亚洲及南北美洲均有暴发或流行报道[18,19,20],在中国山东、河南、浙江省等地也已有暴发报道[1,6,20,21],故建立完善的病原检测体系,扩大肠道病毒监测范围,尽快发现新的病原,了解不同型别肠道病毒的流行状况,明确不同病原与临床症状的联系,对于肠道病毒相关疾病的控制与临床救治有重要意义。

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