中华预防医学杂志    2018年11期 血红素加氧酶-1在纳米氧化锌致人脐静脉血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用    PDF     文章点击量:91    
中华预防医学杂志2018年11期
中华医学会主办。
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乔亚梅 梁肖 路亚柯 卓来宝 武佳佳 王惠欣 姚武 燕贞
QiaoYamei,LiangXiao,LuYake,ZhuoLaibao,WuJiajia,WangHuixin,YaoWu,YanZhen
血红素加氧酶-1在纳米氧化锌致人脐静脉血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用
The role of heme oxygenase-1 on oxidative stress injury induced by zinc oxide nanoparticles in human umbilical vein endothelial cells line EA.hy926 cells
中华预防医学杂志, 2018,52(11)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.11.016

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投稿日期: 2018-01-30
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血红素加氧酶-1在纳米氧化锌致人脐静脉血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用
乔亚梅 梁肖 路亚柯 卓来宝 武佳佳 王惠欣 姚武 燕贞     
乔亚梅 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
梁肖 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
路亚柯 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
卓来宝 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
武佳佳 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
王惠欣 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
姚武 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
燕贞 450001 河南,郑州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室
摘要: 目的  探讨血红素加氧酶(HO-1)对纳米氧化锌(ZnO-NPs)致人脐静脉血管内皮细胞株(EA.hy926细胞)活性氧水平改变的影响。方法  取对数生长期EA.hy926细胞,分别采用0.0、2.5、5.0、10.0和15.0 mg/L ZnO-NPs溶液进行染毒,4 h后采用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平,计算平均荧光强度(MFI),24 h后采用Western Blot检测细胞内HO-1蛋白表达水平。将15.0 mg/L浓度的ZnO-NPs溶液刺激细胞设定为ZnO-NPs组,同时设定空白对照组。另外使用终浓度为10 μmol/L的HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPPIx)及HO-1激活剂钴原卟啉(CoPPIx)分别预处理细胞,设置为ZnPPIX、CoPPIx组。以终浓度为10 μmol/L的ZnPPIX、CoPPIx预处理EA.hy926细胞1 h后,于培养基中加入15.0 mg/L ZnO-NPs进行培养,分别设定为ZnPPIX+ ZnO-NPs组、CoPPIx+ ZnO-NPs组。各组均于染毒后4 h后检测活性氧水平,计算平均荧光强度(MFI),24 h后检测HO-1表达水平。结果  ZnO-NPs染毒剂量增加,EA.hy926细胞内活性氧与HO-1水平增加(0.0、2.5、5.0、10.0和15.0 mg/L ZnO-NPs染毒组的MFI分别为22 627.22±718.27、24 726.47±568.52、31 141.75±1 312.24、39 824.82±4 774.74、50 569.03±1 497.63,HO-1相对表达量分别为0.16±0.01、0.19±0.02、0.16±0.01、0.23±0.02、0.92±0.06),P值均<0.001。15.0 mg/L ZnO-NPs组HO-1灰度值高于ZnPPIx+ ZnO-NPs组(1.12±0.01比1.05±0.05,P<0.05),且活性氧MFI水平较低(53 654.53±2 229.01比62 683.95±2 589.59,P<0.001);CoPPIx+ ZnO-NPs组HO-1灰度值高于15.0 mg/L ZnO-NPs组(1.74±0.11比0.22±0.03,P<0.001),且活性氧水平较低(32 845.04±993.48比53 654.53±2 229.01,P<0.001)。结论  ZnO-NPs可致EA.hy926细胞发生氧化应激,呈剂量-效应关系,HO-1可调控ZnO-NPs诱发的氧化应激水平。
关键词 :血红素加氧酶-1;细胞;活性氧;纳米氧化锌
The role of heme oxygenase-1 on oxidative stress injury induced by zinc oxide nanoparticles in human umbilical vein endothelial cells line EA.hy926 cells
QiaoYamei,LiangXiao,LuYake,ZhuoLaibao,WuJiajia,WangHuixin,YaoWu,YanZhen     
Department of Occupational and Environmental Health Sciences, School of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450001, China
Corresponding author: Yan Zhen, Email: yanzhen@zzu.edu.cn
Abstract:Objective  To explore the effect of heme oxygenase-1 (HO-1) on level of reactive oxygen species (ROS) induced by zinc oxide nanoparticles (ZnO-NPs) in Human umbilical vein endothelial cells line EA.hy926.Methods  The EA.hy926 cells in logarithmic growth phase were incubated with 0.0, 2.5, 5.0, 10.0 and 15.0 mg/L ZnO-NPs respectively. The ROS level, reflected by mean fluorescence intensity (MFI), was examined by flow cytometer after 4 hours exposure, the protein expression of HO-1 which was determined by Western Blot after exposed to ZnO-NPs for 24 hours. Cells incubated with 15.0 mg/L were set as the ZnO-NPs group; a blank control group was set at the same time. Cells were pretreated with HO-1 inhibitor zinc protoporphyrin (ZnPPIx) and HO-1 activator cobalt protoporphyrin (CoPPIx), they were classified as ZnPPIx group and CoPPIx group. 15 mg/L ZnO-NPs was chosen to conduct the experiment of HO-1 activation and inhibition. Cells were classified as ZnPPIX+ ZnO-NPs group and CoPPIx+ ZnO-NPs group after pretreated with 10 μmol/L ZnPPIx or CoPPIx for 1 h, added 15 mg/L ZnO-NPs to cell culture medium. In all groups ROS levels were detected after exposed to ZnO-NPs for 4 hours, the protein expression of HO-1 was detected after exposed to ZnO-NPs for 24 hours.Results  With the increased dose of ZnO-NPs, levels of ROS and HO-1 in EA.hy926 cells were clearly elevated (the MFI of 0.0, 2.5, 5.0, 10.0 and 15.0 mg/L ZnO-NPs incubated groups was 22 627.22±718.27, 24 726.47±568.52, 31 141.75±1 312.24, 39 824.82±4 774.74, 50 569.03±1 497.63 respectively, and HO-1 relative expression were 0.16±0.01, 0.19±0.02, 0.16±0.01, 0.23±0.02, 0.92±0.06 respectively). HO-1 expression in ZnPPIx pretreatment group decreased compared with ZnO-NPs group (1.05±0.05 vs. 1.12±0.01, P<0.05), meanwhile ROS level enhanced (62 683.95±2 589.59 vs. 53 654.53±2 229.01, P<0.05). However, CoPPIx pretreatment had higher HO-1 level and lower level of ROS compared with ZnO-NPs group (HO-1: 1.74±0.11 vs. 0.22±0.03, P<0.05; ROS: 32 845.04±993.48 vs. 53 654.53±2 229.01, P<0.05).Conclusions  Exposure to ZnO-NPs significantly induced ROS generation in EA.hy926 cells in a dose-dependent manner. HO-1 regulated ZnO-NPs-induced oxidative stress.
Key words :Heme oxygenase-1;Cells;Reactive oxygen species;Zinc oxide nanoparticles
全文

纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticles,ZnO-NPs)是一种新型无机材料,其粒径介于1~100 nm之间,是世界上产量较高的纳米材料之一,被广泛应用于生产生活中[1]。ZnO-NPs可通过呼吸道、消化道等途径进入人体,对心血管系统、呼吸系统、神经系统等造成损伤[2,3,4]。研究发现ZnO-NPs可致人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)和人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells, HCAEC)出现氧化应激与炎症反应[3,5],而内皮细胞受损后可能导致其屏障功能受损进而导致多种心血管疾病的发生[6]。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)是催化血红素降解的起始酶和限速酶,参与体内多种抗炎和抗氧化过程[7]。研究发现抑制HO-1表达可导致氧化低密度脂蛋白引起的HUVEC炎症反应加重[8],但也有研究发现激活HO-1并未减轻PM2.5引起的人肺泡上皮细胞损伤[9]。目前关于HO-1是否影响ZnO-NPs刺激内皮细胞引起的活性氧水平改变尚不清楚[10,11,12,13,14,15,16],本实验以HUVEC株(EA.hy926)为研究对象,旨在探究ZnO-NPs对EA.hy926细胞的氧化损伤作用以及HO-1对活性氧水平的影响。

材料与方法  

一、实验细胞及培养  HUVEC株的EA.hy926细胞由中国科学院细胞库提供。将EA.hy926细胞置于DMEM高糖培养基(含体积分数为10%的胎牛血清,1%的100×青链霉素混合液),置于37 ℃、体积分数为5%二氧化碳培养箱中培养,2~3 d换液1次,当细胞融合度为80%~90%时,以质量分数为0.25%胰蛋白酶常规消化传代。

二、仪器和试剂  Accuri C6流式细胞仪购于美国BD公司;DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、100×青链霉素混合液购于美国HyClone公司;胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)购于上海碧云天生物技术有限公司;β-actin抗体购于美国SantaCruz公司,HO-1抗体购于美国Cell Signaling公司;钴原卟啉(cobalt protoporphyrin,CoPPIx)、锌原卟啉(zinc protoporphyrin,ZnPPIx)购于美国Sigma公司;ZnO-NPs购于南京海泰纳米有限公司,纯度为99.50%,球状,颗粒平均直径为41.7 nm,比表面积为18.4 m2/g[10]。用PBS配制质量浓度为1.0 g/L的ZnO-NPs溶液,染毒前进行超声处理(每次2 min,共3次)。

三、方法  

1.ZnO-NPs对EA.hy 926细胞存活率的影响:  将细胞按5×103个/孔的密度接种于96孔板中,每孔100 μl,置于37 ℃培养箱中培养至对数生长期后,更换培养基,根据预实验结果以及梁肖等[17]结果,以质量浓度为0.0、2.5、5.0、10.0、15.0 mg/L的ZnO-NPs染毒24 h,弃培养基PBS清洗后每孔加入100 μl CCK-8,避光孵育1.5 h,用酶标仪以450 nm波长测量吸光度值(A值),细胞存活率=[(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%。其中A实验组值为具有细胞、CCK 8溶液、ZnO-NPs的孔的吸光度值,A对照组值为只具有细胞和CCK 8溶液的孔的吸光度,A空白组为CCK 8溶液的孔的吸光度。

2.细胞内活性氧水平测定:  取EA.hy926细胞以密度3×108个/L接种于6孔板中,待细胞生长至对数生长期。分别以质量浓度为0.0、2.5、5.0、10.0和15.0 mg/L的ZnO-NPs溶液[17]刺激EA.hy926细胞,4 h后,以PBS清洗,每孔中加入含浓度为10 μmol/L DCFH-DA(探针)的DMEM完全培养基1 ml,37℃孵育30 min,PBS清洗后以胰蛋白酶消化细胞。收集细胞悬液,1 000×g离心5 min后PBS重悬。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度,计算平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI),用探针的MFI反映细胞内的活性氧水平。

3.不同组别细胞内HO-1蛋白表达水平测定:  (1)ZnO-NPs组:根据CCK-8及HO-1蛋白表达结果,采用15.0 mg/L ZnO-NPs溶液刺激EA.hy926细胞24 h,设置为ZnO-NPs组,同时设定空白组作为对照。采用常规方法提取细胞蛋白测定蛋白浓度。蛋白上样量20 μg,10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后,恒流转至PVDF膜。质量分数为5%脱脂牛奶封闭1 h,TBST洗3次,每次10 min,加一抗(HO-1,β-actin抗体分别按1:1 000,1:200稀释),4 ℃过夜,TBST洗膜,加相应二抗孵育1.5 h,TBST漂洗后用ECL试剂盒显影成像。用Image J 2.0软件对Western blot结果进行相对定量。(2)ZnPPIX、CoPPIx组:将HO-1抑制剂ZnPPIx、HO-1激活剂CoPPIx溶解于0.1 mol/L NaOH溶液中,使用0.1 mol/L盐酸调节PH至7.0,PBS稀释至1 mmol/L,过滤除菌4 ℃存储待用,分别设定为ZnPPIX、CoPPIx组。ZnO-NPs染毒后测定活性氧与HO-1表达水平。(3)ZnPPIX+ ZnO-NPs、CoPPIx+ ZnO-NPs组:根据CCK-8及HO-1蛋白表达结果,选择15.0 mg/L的ZnO-NPs进行HO-1抑制与激活实验。以终浓度为10 μmol/L的ZnPPIX、CoPPIx预处理EA.hy926细胞1 h后,于培养基中加入15.0 mg/L ZnO-NPs进行培养,分别设定为ZnPPIX+ ZnO-NPs、CoPPIx+ ZnO-NPs组。ZnO-NPs染毒后测定活性氧与HO-1表达水平。

四、统计学分析  采用SPSS 21.0软件进行统计分析。细胞活力、存活率、HO-1蛋白相对表达灰度值、MFI符合正态分布,以±s描述,不同染毒剂量组的比较采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD检验;采用一元线性回归分析EA.hy926细胞活性氧水平和ZnO-NPs染毒剂量的剂量-效应关系,通过F值大小判断回归方程的统计学意义。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.ZnO-NPs对EA.hy 926细胞存活率的影响:  ZnO-NPs染毒剂量≤5.0 mg/L时,细胞存活率与对照组相比,差异没有统计学意义(P>0.05),当染毒剂量≥10.0 mg/L时细胞存活率降低,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1不同浓度ZnO-NPs对细胞存活率的影响(±sn=5)

2.ZnO-NPs对EA.hy926细胞活性氧水平的影响:  不同浓度ZnO-NPs组EA.hy926细胞活性氧水平差异有统计学意义(P<0.05),见表2。EA.hy926细胞活性氧水平和ZnO-NPs染毒剂量的一元线性回归分析方程为?=1 907.09x+21 381.77,R2=0.959,F=301.22,P<0.001;回归系数检验结果显示,t=17.35,P<0.001。EA.hy926细胞活性氧水平随着染毒剂量的增加而升高,呈剂量-效应关系。

表2不同ZnO-NPs对EA.hy926细胞活性氧水平的影响(±sn=3)

3.不同浓度ZnO-NPs对EA.hy926细胞HO-1表达水平影响:  比较不同浓度ZnO-NPs处理24 h后EA.hy926细胞HO-1蛋白表达水平,可见ZnO-NPs浓度在0.0~5.0 mg/L下,ZnO-NPs浓度与对照组相比HO-1蛋白表达水平差异无统计学意义,ZnO-NPs浓度为10.0、15.0 mg/L时,HO-1的表达量高于对照组(表3)。

表3不同浓度ZnO-NPs下EA.hy926细胞HO-1蛋白表达水平(±sn=3)

4.抑制HO-1表达对EA.hy926细胞活性氧水平的影响:  与空白组相比ZnPPIx预处理可使HO-1表达水平降低(表4)。与ZnO-NPs组相比,ZnPPIx预处理可降低ZnO-NPs诱导的HO-1高表达(表4),导致活性氧水平升高。

表4HO-1抑制剂处理下EA.hy926细胞HO-1蛋白及活性氧水平(±sn=3)

5.激活HO-1表达对EA.hy926细胞活性氧水平的影响:  与空白组相比,CoPPIx预处理可使HO-1表达水平升高;与ZnO-NPs组相比,CoPPIx预处理可提高ZnO-NPs诱导的HO-1表达水平(表5),且活性氧水平降低。

表5HO-1激活剂处理下EA.hy926细胞HO-1蛋白及活性氧水平(±sn=3)

讨论  ZnO-NPs是一种新型纳米材料,目前被广泛应用于工程、医药、科学等领域[11]。研究证明ZnO-NPs对人心血管系统、神经系统、呼吸系统等都有一定的损害作用[4,12]。ZnO-NPs进入机体后活性氧的产生,Zn2+的溶解和释放以及纳米颗粒与细胞壁膜之间的物理相互作用等现象的结合导致了氧化应激的出现[13],进而可能导致内皮细胞结构或功能受损导致多种心血管疾病的发生,其中活性氧的产生是导致内皮细胞受损的关键因素之一[6]。活性氧主要来源于线粒体呼吸和NADPH氧化酶家族,二者产生的O2-可在胞质中由SODs转化为H2O2,与亚铁离子或亚铜离子反应后形成OH·自由基,对DNA,蛋白质和膜脂质造成损害[14],故可通过检测胞内活性氧水平来反映细胞氧化应激情况。Kapuku等[15]研究表明氧化应激水平、血压的改变与心血管疾病之间有着密切关联,机体发生氧化应激时活性氧大量产生可促进局部炎症反应,诱导血管基因改变,使血管平滑肌细胞增殖导致血管壁增厚、血管狭窄,进而影响动脉粥样硬化、高血压等疾病的发生发展过程。本实验结果表明,在不同浓度ZnO-NPs刺激下,EA.hy926细胞活性氧水平呈剂量依赖性增高,二者呈剂量-效应关系,说明ZnO-NPs可导致EA.hy926细胞活性氧水平升高,导致氧化应激反应出现。该结果与ZnO-NPs刺激A549细胞及HUVEC细胞结果一致[5,16]
        HO-1是血红素降解的起始酶和限速酶,HO-1通过其产物CO、胆红素、Fe2+而发挥细胞保护作用,维持血管内皮细胞的正常生理功能,减轻氧化应激损伤。正常情况下HO-1表达处于相对稳定的水平,氧化应激、炎症介质等均可诱导HO-1的表达[17]。本研究发现正常情况下EA.hy926细胞HO-1表达量相对较低,在ZnO-NPs刺激下,HO-1的表达随着ZnO-NPs浓度增加而升高,该结果与晋乐飞等[18]研究结果相一致,HCAEC细胞中HO-1水平随ZnO-NPs浓度增加而升高。说明ZnO-NPs刺激细胞生成活性氧,发生氧化应激的同时,也激活了HO-1的表达。CoPPIx预处理可进一步激活HO-1,发挥抗氧化功能而降低活性氧水平,ZnPPIx预处理可抑制HO-1的表达,从而使活性氧水平升高,说明在ZnO-NPs引起EA.hy926细胞发生氧化应激过程中HO-1在一定程度上可抑制氧化应激的水平,进而对机体起到一定的保护作用。该结果与Lawal等[19]研究结果相一致,汽车尾气颗粒物刺激人微血管内皮细胞会使HO-1的水平升高,抑制HO-1会增加活性氧的产生,激活HO-1会使活性氧生成减少。有研究提出小鼠腹腔巨噬细胞可通过PI3K/Akt,ERK1和p38信号通路实现上调HO-1的表达来抑制炎性反应[11],HO-1能够增加细胞外超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的表达,有效清除细胞基质中的超氧阴离子[19],HO-1及其产物可通过抑制NF-κB激活,维持细胞氧化还原平衡状态,从而减缓氧化应激,发挥细胞保护作用。
        综上所述,ZnO-NPs可使EA.hy926细胞活性氧水平升高,并可诱导HO-1的表达。激活HO-1可以保护EA.hy926细胞,减弱ZnO-NPs诱发的氧化应激,抑制HO-1能够显著增强ZnO-NPs诱发的氧化应激。但目前HO-1在ZnO-NPs引起的内皮细胞氧化应激中的作用机制尚不明确,有待进一步研究探讨。

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