氟以化合物的形式广泛分布在自然界中，摄入过多会对机体造成全身性的损害，过量氟可导致甲状腺结构改变和功能异常^[1,2,3]，但氟对甲状腺毒性的作用机制目前尚不完全清楚，有研究表明细胞凋亡参与了氟所致体外甲状腺细胞的损伤^[4,5]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是近年来才发现的一种新的细胞凋亡途径，外界毒物可通过诱导持续的ERS引起细胞凋亡^[6,7]。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）是ERS反应的标志性蛋白，C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）是ERS由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子^{[8,9,10,11,12]}。本实验通过饮水途径建立氯化钠（NaF）诱导的大鼠慢性甲状腺损伤模型，检测大鼠甲状腺组织形态和细胞凋亡情况以及甲状腺组织中GRP78和CHOP的表达水平，探讨内质网应激诱导的细胞凋亡在过量氟导致的大鼠甲状腺损伤中的作用。

材料与方法  

1.动物分组及处理：  选择由湖北省实验动物研究中心[动物许可证号为SCXK（鄂）2008-0005]提供的断乳1个月的Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重110~130 g。于动物饲养室（温度22~24 ℃，相对湿度40%~60%）适应性饲养1周后采用随机数字表法分为4组，分别为对照组和低、中、高浓度NaF染毒组，每组10只，雌雄各半。在以往的研究的基础上，并参考人群暴露水平^[10]，最终采用含NaF浓度为5、10、20 mg/L的自来水进行染毒，对照组饮用自来水（氟离子浓度为0.344 mg/L）。采用自由饮水方式进行染毒，参考万良斌等^[10]、邓超男等^[11]和Chen等^[12]的研究所采用的染毒周期选择本次研究的染毒时间，连续染毒8个月后处死。

2.主要仪器和试剂：  氟离子选择电极和甘汞电极（上海恒磁电子科技有限公司）；PXD-12型数字式离子计（上海恒磁电子科技有限公司）；核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司）；DPTC-200型PCR仪（美国MJ Research公司）；Ckx41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；NaF（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；氯化钠、柠檬酸三钠、冰醋酸、氢氧化钠（分析纯，天津市化学试剂厂）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（瑞士Roche公司）；二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine, DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物公司）；兔抗大鼠GRP78多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；兔抗大鼠CHOP多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司)；逆转录第一链cDNA合成试剂盒（美国ThermoFisher公司）；PCR染料（美国ThermoFisher公司）；凝胶成像仪（美国赛默飞公司）引物由北京擎科新业生物技术公司设计合成。

3.标本的采集与处理：  动物处死后迅速分离甲状腺，生理盐水冲洗，滤纸吸干后将一侧甲状腺置于质量-体积浓度为4%的多聚甲醛中固定，用于甲状腺组织形态观察，并进行凋亡细胞和蛋白表达的检测；另一侧甲状腺液氮速冻后于-70 ℃保存，用于逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）实验。

4.尿氟的测定：  尿氟含量检测参照《尿中氟化物测定离子选择电极法标准（WS/T89-2015）》^[13]。

5.甲状腺组织形态学观察：  固定于多聚甲醛中的甲状腺经脱水、石蜡包埋、切片后，HE染色，于光学显微镜下观察甲状腺组织形态改变。

6.甲状腺组织凋亡细胞检测：  采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒对甲状腺组织凋亡细胞进行检测，检测过程按照试剂盒说明进行。光学显微镜下观察，正常细胞核呈深蓝色，凋亡细胞核固缩呈棕褐色，为圆形、新月形或不规则形。每组内每张切片采用单纯随机法挑选5个400倍视野进行拍照。拍照时让组织充满整个视野。应用Image-Pro Plus 6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞的比率（阳性细胞数/总细胞数）。

7．甲状腺组织GRP78 mRNA和CHOP mRNA表达检测：  采用RT-PCR法进行检测。取一侧甲状腺组织，用TRIzol试剂提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度。参照逆转录第一链cDNA合成试剂盒说明书对总mRNA进行逆转录，合成cDNA，以cDNA为模板加入相应反应体系的试剂进行PCR扩增（引物见表1）。扩增参数：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延长1 min，进行35个循环，最后72 ℃延伸7 min终止反应。以β-actin作为内参，PCR产物在Tris电泳缓冲液（Tris-Borate EDTA Buffer, TBE Buffer）中进行2%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像分析仪上进行吸光度扫描并采用Quantity One软件分析目的条带与内参条带的灰度值，二者比值即为目的mRNA的相对含量。

表1RT-PCR扩增引物

表选项

8.甲状腺组织GRP78和CHOP蛋白表达检测：  石蜡切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，3%过氧化氢液室温孵育10 min，滴加抗体（GRP78抗体1∶300稀释，CHOP抗体1∶100稀释），4 ℃过夜，PBS冲洗后分别加入羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶，作用30 min，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明、树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。每组内每张切片随机挑选5个400倍视野进行拍照，应用Image-Pro Plus 6.0软件分析每张照片蛋白的阳性率，以光密度值表示阳性染色强度。

9.统计学分析：  采用SPSS 17.0统计软件处理实验数据，不同染毒组大鼠尿氟、凋亡细胞比率、GRP78 mRNA和CHOP mRNA相对表达量、GRP78和CHOP蛋白表达水平符合正态分布，以±s表示，采用单因素方差分析比较不同组别差异，采用LSD-t检验法进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.NaF对大鼠尿液中氟浓度的影响：  低、中、高浓度NaF染毒组大鼠尿氟浓度均高于对照组（P<0.05），且中、高浓度NaF染毒组大鼠尿氟浓度高于低浓度组（P<0.05），高浓度组大鼠尿氟浓度高于中浓度组（P<0.05）（表2）。

表2不同NaF染毒浓度下各组大鼠尿液中氟水平比较（±s，n=10）

表选项

2.NaF对大鼠甲状腺组织形态的影响：  对照组大鼠甲状腺滤泡呈较均匀的中等大小，上皮细胞多为单层立方状，滤泡腔内胶质丰富，清晰均匀；但NaF染毒组大鼠甲状腺滤泡从低浓度组却出现多形性变化：滤泡增生，滤泡腔变小，胶质减少，甚至出现无腔细胞团（图1）。

图1不同NaF染毒浓度下各组大鼠甲状腺组织形态（×200）A：对照组（染毒浓度为0.344 mg/L）；B：低浓度NaF染毒组（染毒浓度为5.000 mg/L）；C：中浓度NaF染毒组（染毒浓度为10.000 mg/L）；D：高浓度NaF染毒组（染毒浓度为20.000 mg/L）

图选项

3.NaF对大鼠甲状腺组织细胞凋亡的影响：  TUNEL法染色结果显示：中、高浓度NaF染毒组大鼠甲状腺组织阳性细胞比率较对照组明显增多（P<0.05），且高浓度组大鼠甲状腺阳性细胞比率较低浓度组明显增加（P<0.05），见表3、图2。

表3不同NaF染毒浓度下各组大鼠甲状腺组织凋亡细胞比率（±s，n=10）

表选项

图2TUNEL法检测不同NaF染毒浓度各组大鼠甲状腺组织细胞凋亡情况（×400）A：对照组（染毒浓度为0.344 mg/L）；B：低浓度NaF染毒组（染毒浓度为5.000 mg/L）；C：中浓度NaF染毒组（染毒浓度为10.000 mg/L）；D：高浓度NaF染毒组（染毒浓度为20.000 mg/L）

图选项

4．NaF对大鼠甲状腺组织中GRP78和CHOP表达的影响：  表4结果显示，低、中、高浓度NaF染毒组大鼠甲状腺组织中GRP78 mRNA表达均高于对照组（P<0.05）。中、高浓度NaF染毒组大鼠甲状腺组织中CHOP mRNA表达高于对照组（P<0.05），且高浓度组CHOP mRNA表达高于低浓度组，差异有统计学意义（P<0.05）；表5结果显示，中、高浓度NaF染毒组大鼠甲状腺组织中GRP78和CHOP蛋白表达高于对照组（P<0.05），见图3、图4。

表4不同NaF染毒浓度下各组大鼠甲状腺组织GRP78 mRNA和CHOP mRNA相对表达量（±s，n=10）

表选项

表5不同NaF染毒浓度下各组大鼠甲状腺组织GRP78和CHOP蛋白表达水平（±s，n=10）

表选项

图3免疫组化法检测各组大鼠甲状腺组织GRP78蛋白的表达（×400）A：对照组（染毒浓度为0.344 mg/L）；B：低浓度NaF染毒组（染毒浓度为5.000 mg/L）；C：中浓度NaF染毒组（染毒浓度为10.000 mg/L）；D：高浓度NaF染毒组（染毒浓度为20.000 mg/L）

图选项

图4免疫组化法检测不同NaF染毒浓度下各组大鼠甲状腺组织CHOP蛋白的表达（×400）A：对照组（染毒浓度为0.344 mg/L）；B：低浓度NaF染毒组（染毒浓度为5.000 mg/L）；C：中浓度NaF染毒组（染毒浓度为10.000 mg/L）；D：高浓度NaF染毒组（染毒浓度为20.000 mg/L）

图选项

讨论  过量氟造成的损伤以骨相损害为主，同时可损害非骨相组织^{[14,15,16,17]}。迄今为止，有关氟对骨骼、牙齿等硬组织的损害已进行了较深入的研究。近年来，氟对甲状腺等软组织的损伤引起广泛关注，流行病学调查发现，在高氟地区存在着甲状腺肿的流行^[18]，体内外实验均证明过量氟可损伤甲状腺结构和功能^{[1, 5]}。本次研究尿氟测定结果显示，各组大鼠尿液中氟水平与其摄入水平基本呈平行关系，尿液中氟的浓度是反映机体内氟暴露水平的有效指标，同时也是评价动物模型是否构建成功的直观指标，由此可初步认为氟过量Wistar大鼠动物模型构建成功。本次研究结果显示，过量氟可使大鼠甲状腺组织形态发生明显变化，表现为甲状腺滤泡形状及大小的改变及滤泡腔内胶质的改变，验证了高氟对甲状腺组织的损伤。通过TUNEL凋亡检测可见NaF染毒组大鼠甲状腺组织凋亡细胞较对照组明显增加，其中以高浓度组为甚，说明细胞凋亡在过量氟导致的大鼠甲状腺组织损伤过程中发挥作用。
        细胞凋亡是机体在一定的生理和病理条件下，主动清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡的一种程序性死亡方式。目前已经确定的细胞凋亡通路有三条：死亡受体通路、线粒体通路及内质网通路^[19,20]。内质网是蛋白质合成和加工的重要场所，当未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔聚集，则会产生ERS，ERS既是细胞抵抗外界不良刺激的保护机制，也是细胞应激的损伤机制。GRP78是ERS反应的标志性蛋白，被认为是ERS信号途径上游的分子开关，在无ERS时，GRP78和3个ERS感应蛋白：双链RNA活化蛋白激酶PKR样内质网激酶（PKR-like ER kinase，PERK)、活化转录因子6 (activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇必需酶1 (inositol-requiring enzyme 1，IRE1）结合，处于无活性状态。ERS存在时，GRP78解离启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR)，促进内质网对未折叠和错误折叠蛋白质的处理，进而维持细胞存活状态。但当ERS过于强烈时亦会通过UPR启动凋亡程序，在此过程中CHOP是ERS由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子^[8,9]。本研究中NaF染毒组大鼠甲状腺组织中GRP78基因及蛋白的表达较对照组均明显增加，说明过量氟可诱导甲状腺细胞发生ERS，NaF染毒组CHOP基因及蛋白表达增高，表明ERS通过转录因子CHOP的激活介导甲状腺组织中细胞凋亡的发生。
        本研究发现NaF染毒组凋亡细胞明显增加，说明细胞凋亡在氟导致的甲状腺毒性中扮演重要的角色；过量氟使大鼠甲状腺组织中ERS标志分子GRP78和CHOP的水平出现不同程度的增加，说明ERS参与了氟导致的甲状腺损伤，且通过上调CHOP表达的机制诱导细胞凋亡的发生。