中华医学会主办。
文章信息
- 于林玉 崔玉山 刘洪亮
- YuLinyu,CuiYushan,LiuHongliang
- 内质网应激诱导的细胞凋亡在氟致大鼠甲状腺损伤中的作用
- Effects of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in thyroid injury caused by fluoride in rat
- 中华预防医学杂志, 2018,52(11)
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.11.017
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文章历史
- 投稿日期: 2018-02-06
崔玉山 天津市疾病预防控制中心环境与健康室
刘洪亮 天津市疾病预防控制中心预防医学研究所 天津市卫生计生综合监督所
Corresponding author: Liu Hongliang, Email: hongliang_liu@sina.com
氟以化合物的形式广泛分布在自然界中,摄入过多会对机体造成全身性的损害,过量氟可导致甲状腺结构改变和功能异常[
材料与方法
1.动物分组及处理: 选择由湖北省实验动物研究中心[动物许可证号为SCXK(鄂)2008-0005]提供的断乳1个月的Wistar大鼠40只,雌雄各半,体重110~130 g。于动物饲养室(温度22~24 ℃,相对湿度40%~60%)适应性饲养1周后采用随机数字表法分为4组,分别为对照组和低、中、高浓度NaF染毒组,每组10只,雌雄各半。在以往的研究的基础上,并参考人群暴露水平[
2.主要仪器和试剂: 氟离子选择电极和甘汞电极(上海恒磁电子科技有限公司);PXD-12型数字式离子计(上海恒磁电子科技有限公司);核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司);DPTC-200型PCR仪(美国MJ Research公司);Ckx41型倒置显微镜(日本Olympus公司);NaF(分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司);氯化钠、柠檬酸三钠、冰醋酸、氢氧化钠(分析纯,天津市化学试剂厂);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(瑞士Roche公司);二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物公司);兔抗大鼠GRP78多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);兔抗大鼠CHOP多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);TRIzol试剂(美国Invitrogen公司);逆转录第一链cDNA合成试剂盒(美国ThermoFisher公司);PCR染料(美国ThermoFisher公司);凝胶成像仪(美国赛默飞公司)引物由北京擎科新业生物技术公司设计合成。
3.标本的采集与处理: 动物处死后迅速分离甲状腺,生理盐水冲洗,滤纸吸干后将一侧甲状腺置于质量-体积浓度为4%的多聚甲醛中固定,用于甲状腺组织形态观察,并进行凋亡细胞和蛋白表达的检测;另一侧甲状腺液氮速冻后于-70 ℃保存,用于逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)实验。
4.尿氟的测定: 尿氟含量检测参照《尿中氟化物测定离子选择电极法标准(WS/T89-2015)》[
5.甲状腺组织形态学观察: 固定于多聚甲醛中的甲状腺经脱水、石蜡包埋、切片后,HE染色,于光学显微镜下观察甲状腺组织形态改变。
6.甲状腺组织凋亡细胞检测: 采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒对甲状腺组织凋亡细胞进行检测,检测过程按照试剂盒说明进行。光学显微镜下观察,正常细胞核呈深蓝色,凋亡细胞核固缩呈棕褐色,为圆形、新月形或不规则形。每组内每张切片采用单纯随机法挑选5个400倍视野进行拍照。拍照时让组织充满整个视野。应用Image-Pro Plus 6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞的比率(阳性细胞数/总细胞数)。
7.甲状腺组织GRP78 mRNA和CHOP mRNA表达检测: 采用RT-PCR法进行检测。取一侧甲状腺组织,用TRIzol试剂提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度。参照逆转录第一链cDNA合成试剂盒说明书对总mRNA进行逆转录,合成cDNA,以cDNA为模板加入相应反应体系的试剂进行PCR扩增(引物见
8.甲状腺组织GRP78和CHOP蛋白表达检测: 石蜡切片常规脱蜡至水,微波修复抗原,3%过氧化氢液室温孵育10 min,滴加抗体(GRP78抗体1∶300稀释,CHOP抗体1∶100稀释),4 ℃过夜,PBS冲洗后分别加入羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶,作用30 min,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。每组内每张切片随机挑选5个400倍视野进行拍照,应用Image-Pro Plus 6.0软件分析每张照片蛋白的阳性率,以光密度值表示阳性染色强度。
9.统计学分析: 采用SPSS 17.0统计软件处理实验数据,不同染毒组大鼠尿氟、凋亡细胞比率、GRP78 mRNA和CHOP mRNA相对表达量、GRP78和CHOP蛋白表达水平符合正态分布,以
结果
1.NaF对大鼠尿液中氟浓度的影响: 低、中、高浓度NaF染毒组大鼠尿氟浓度均高于对照组(
2.NaF对大鼠甲状腺组织形态的影响: 对照组大鼠甲状腺滤泡呈较均匀的中等大小,上皮细胞多为单层立方状,滤泡腔内胶质丰富,清晰均匀;但NaF染毒组大鼠甲状腺滤泡从低浓度组却出现多形性变化:滤泡增生,滤泡腔变小,胶质减少,甚至出现无腔细胞团(
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图1不同NaF染毒浓度下各组大鼠甲状腺组织形态(×200)A:对照组(染毒浓度为0.344 mg/L);B:低浓度NaF染毒组(染毒浓度为5.000 mg/L);C:中浓度NaF染毒组(染毒浓度为10.000 mg/L);D:高浓度NaF染毒组(染毒浓度为20.000 mg/L) |
3.NaF对大鼠甲状腺组织细胞凋亡的影响: TUNEL法染色结果显示:中、高浓度NaF染毒组大鼠甲状腺组织阳性细胞比率较对照组明显增多(
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图2TUNEL法检测不同NaF染毒浓度各组大鼠甲状腺组织细胞凋亡情况(×400)A:对照组(染毒浓度为0.344 mg/L);B:低浓度NaF染毒组(染毒浓度为5.000 mg/L);C:中浓度NaF染毒组(染毒浓度为10.000 mg/L);D:高浓度NaF染毒组(染毒浓度为20.000 mg/L) |
4.NaF对大鼠甲状腺组织中GRP78和CHOP表达的影响:
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图3免疫组化法检测各组大鼠甲状腺组织GRP78蛋白的表达(×400)A:对照组(染毒浓度为0.344 mg/L);B:低浓度NaF染毒组(染毒浓度为5.000 mg/L);C:中浓度NaF染毒组(染毒浓度为10.000 mg/L);D:高浓度NaF染毒组(染毒浓度为20.000 mg/L) |
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图4免疫组化法检测不同NaF染毒浓度下各组大鼠甲状腺组织CHOP蛋白的表达(×400)A:对照组(染毒浓度为0.344 mg/L);B:低浓度NaF染毒组(染毒浓度为5.000 mg/L);C:中浓度NaF染毒组(染毒浓度为10.000 mg/L);D:高浓度NaF染毒组(染毒浓度为20.000 mg/L) |
讨论 过量氟造成的损伤以骨相损害为主,同时可损害非骨相组织[
细胞凋亡是机体在一定的生理和病理条件下,主动清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡的一种程序性死亡方式。目前已经确定的细胞凋亡通路有三条:死亡受体通路、线粒体通路及内质网通路[
本研究发现NaF染毒组凋亡细胞明显增加,说明细胞凋亡在氟导致的甲状腺毒性中扮演重要的角色;过量氟使大鼠甲状腺组织中ERS标志分子GRP78和CHOP的水平出现不同程度的增加,说明ERS参与了氟导致的甲状腺损伤,且通过上调CHOP表达的机制诱导细胞凋亡的发生。
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