中华预防医学杂志    2018年11期 三种水中诺如病毒富集方法的比较    PDF     文章点击量:229    
中华预防医学杂志2018年11期
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吴俊 孙腾云 赵明 刘青 袁淑红 邵飞琴
WuJun,SunTengyun,ZhaoMing,LiuQing,YuanShuhong,ShaoFeiqin
三种水中诺如病毒富集方法的比较
A comparative study on the three methods of concentration of norovirus from water
中华预防医学杂志, 2018,52(11)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.11.018

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投稿日期: 2017-12-06
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三种水中诺如病毒富集方法的比较
吴俊 孙腾云 赵明 刘青 袁淑红 邵飞琴     
吴俊 311300 杭州市临安区疾病预防控制中心卫生检验科
孙腾云 311300 杭州市临安区疾病预防控制中心卫生检验科
赵明 311300 杭州市临安区疾病预防控制中心卫生检验科
刘青 311300 杭州市临安区疾病预防控制中心卫生检验科
袁淑红 311300 杭州市临安区疾病预防控制中心卫生检验科
邵飞琴 311300 杭州市临安区疾病预防控制中心卫生检验科
摘要:
关键词 :水;诺罗病毒;逆转录聚合酶链反应;富集
A comparative study on the three methods of concentration of norovirus from water
WuJun,SunTengyun,ZhaoMing,LiuQing,YuanShuhong,ShaoFeiqin     
Institute for Health Inspection, The Center for Disease Control and Prevention of Linan District, Hangzhou, Zhejiang 311300, China
Corresponding author: Wu Jun, Email: wj231@163.com
Abstract:
Key words :Water;Norovirus;Reverse transcriptase polymerase chain reaction;Concentration
全文

诺如病毒是一种重要的食源性及水源性病毒,该病毒常通过污染水源引起急性胃肠炎的暴发[1]。21世纪以来,在全球范围内,很多国家都报道了诺如病毒感染的暴发事件[2,3]。由于水中诺如病毒含量较低,往往需要经过富集才能通过荧光定量PCR仪检测到。本研究对应用广泛的3种病毒富集方法,絮凝沉淀法、聚二乙醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法和阴离子膜法进行了比较评价,通过计算诺如病毒的回收率,以获得一种较好的方法[4,5,6],应用于实际检测工作中。

一、材料与方法  

1.GⅡ型诺如病毒标本液的制备:  取1 ml由本单位实验室检出的GⅡ型诺如病毒阳性的粪便标本,加入10 ml灭菌水中,充分振荡混匀后,以4 000×g离心5 min,取上清液通过0.45 μm水相滤器过滤,再用灭菌蒸馏水稀释后,分装成每管1.0 ml,作为加标用的病毒标本液,并于-80 ℃保存备用。

2.试剂与仪器:  One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit购自宝日医生物科技(北京)有限公司(货号:RR064a);RNA提取试剂盒Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit购自德国Qiagen公司(货号:52906);含有GⅡ型诺如病毒特异片段的质粒购自江苏硕世生物有限公司;CFX96 Touch型实时荧光定量PCR仪购自美国伯乐公司;0.45 μm硝酸纤维素滤膜(直径5 cm)购自美国millipore公司。

3.引物探针:  根据文献[4],合成引物探针,用于荧光定量PCR检测GⅡ型诺如病毒和含有GⅡ型诺如病毒特异片段的标准质粒。引物探针由上海生工生物科技公司合成。

4.病毒浓度及Ct值计算:  将含GⅡ型诺如病毒特异性扩增片段的质粒稀释10倍,用紫外分光光度计测定浓度,并根据公式换算成拷贝数,得到浓度为9.1×1010拷贝/μl的质粒。再将其进行10倍逐级稀释为7个浓度(分别为9.1×1010、9.1×109、9.1×108、9.1×107、9.1×106、9.1×105、9.1×104拷贝/μl);用荧光定量PCR分别测得不同浓度的Ct值,并重复3次。其中,质粒拷贝数根据质粒分子量及阿伏伽德罗常数换算进行计算,计算公式:dsDNA浓度(μg/ml)=50×(吸光度值:260 nm)×稀释倍数;质粒的拷贝数=浓度/质粒相对分子质量×阿伏伽德罗常数。

5.基于钙离子的絮凝沉淀法:  取1 L的GⅡ型诺如病毒标本液,加入2 ml浓度为1 mol/L的CaCl2溶液,充分搅拌混合均匀,静置5 min;再加入2 ml浓度为1 mol/L的Na2HPO4溶液,轻微颠倒混匀,静置5 min;0.45 μm滤膜负压过滤;用1.0 ml浓度为1.0 mol/L的柠檬酸溶液对滤膜上的絮凝沉淀进行溶解洗脱,取200 μl洗脱液提取RNA,用荧光定量PCR进行检测。

6.阴离子膜法:  取1 L的GⅡ型诺如病毒标本液,加入50 ml浓度为2 mol/L的MgCl2溶液,使Mg2+终浓度为0.1 mol/L,充分搅拌混合均匀;1 mol/L盐酸溶液调整pH为3.5;采用真空抽滤使水样以0.1 L/min的速度通过孔径为0.45 μm的硝酸纤维素滤膜;用1.0 ml洗脱液(5%牛肉膏,0.05 mol/L甘氨酸,pH 9.5)浸泡5 min后洗脱,取200 μl洗脱液提取RNA,用荧光定量PCR进行检测。

7.PEG沉淀法:  100 ml的GⅡ型诺如病毒标本液加入25 ml质量浓度为50%的聚乙二醇6000溶液,使标本液中聚乙二醇6000的终浓度为10%,再加入10 ml浓度为5 mol/L的NaCl溶液,充分震荡混合均匀,4 ℃冰箱静置过夜;再4 ℃、10 000×g离心30 min,弃去上清液,用滤纸吸去残留液体,向离心管中加入1.0 ml灭菌水悬浮沉淀,取200 μl洗脱液提取RNA,用荧光定量PCR进行检测。

8.病毒回收率计算:  选择3种方法中对病毒富集效果最好的阴离子膜法做进一步分析,取1、5、10 ml,浓度为9.1×106拷贝/μl的病毒标本液分别加入到1、5和10 L灭菌水中,制备出病毒浓度为9.1×103拷贝/μl的模拟水样,通过阴离子膜法富集,将洗脱液洗脱后用荧光定量PCR进行检测,重复操作3次后计算病毒回收率。病毒回收率=富集后得到混悬液中的病毒量/富集前加入样品中的病毒量=富集后所得病毒RNA量/富集前加入病毒RNA量。

9.RNA提取及荧光定量PCR检测:  RNA提取试剂盒说明书操作。反应体系为:2×One Step RT-PCR缓冲液10.0 μl,TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μl,PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4 μl,引物COG2F 0.4 μl,引物COG2R 0.4 μl,探针RING2-TP 0.4 μl,无RNA酶的水3.0 μl,待检测RNA 3.0 μl。反应程序如下:42 ℃反转录20 min;95 ℃预变性10 s;95 ℃变性10 s,再60 ℃退火和扩增30 s,共48个循环;最终于60 ℃进行荧光检测。

10.统计学分析:  采用SPSS 16.0对数据进行整理和统计学分析。病毒回收率和病毒浓度符合正态分布,采用±s表示。以病毒浓度lg转换值为横坐标,以Ct值为纵坐标,建立标准曲线,并计算R2值。以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果  

1.病毒浓度与Ct值线性关系:  10倍梯度稀释后的GⅡ型诺如病毒质粒标准品在扩增后呈现典型S型扩增曲线,荧光信号分析显示,在9.1×104~9.1×1010拷贝/μl时,病毒浓度lg转换值与Ct值关系的公式为:y=-3.37x+46.44(R2=0.999 3,P<0.001),可用于水中诺如病毒检测的定量。

2.GⅡ型诺如病毒标本液浓度的计算:  处理后病毒标本液提取核酸后用荧光定量PCR检测其Ct值,把Ct值代入标准方程计算出浓度为4.1×107拷贝/μl,为便于计算,用灭菌蒸馏水稀释成浓度为9.1×106拷贝/μl,作为试验中加标母液使用。

3.3种不同方法的回收率:  3种方法的回收率都随着模拟水样中病毒浓度的降低而降低。絮凝沉淀法中,当1 L模拟水样的病毒浓度为9.1×101拷贝/μl时,洗脱液中检测不到病毒,而当病毒浓度为9.1×102和9.1×103拷贝/μl,回收率分别为(12.3±2.97)%和(5.7±0.75)%;阴离子膜法中,当1 L模拟水样中病毒浓度为9.1拷贝/μl时,3次重复试验只有1次可以检测到病毒,而当病毒浓度为9.1×101、9.1×102和9.1×103拷贝/μl时,回收率分别为(19.2±3.1)%、(34.8±8.2)%和(37.6±5.82)%;PEG沉淀法中,只有当模拟水样中病毒浓度为9.1×104拷贝/μl时才可以在洗脱液中检测到病毒,病毒浓度为(6.7±1.34)×105拷贝/μl,回收率为(7.4±1.47)%。

4.阴离子膜法对病毒浓度为9.1×103拷贝/μl的富集效果:  当水样体积在1 L时,富集效果较好,1 ml洗脱液的病毒浓度为(3.42±0.53)×106拷贝/μl,病毒回收率为(37.6±5.82)%;当水样体积为5和10 L时,1 ml洗脱液的病毒浓度有所下降,分别为(1.21±0.27)×107和(2.53±0.61)×107拷贝/μl,病毒回收率分别为(26.6±5.93)%和(27.8±6.70)%。

三、讨论  水中病毒的富集方法很多,主要包括:絮凝沉淀法、超滤法、免疫学方法、阴离子膜法和阳离子膜法等[4,5,6,7,8,9,10]。本研究比较了国内使用最广泛且操作简单的3种从水中富集诺如病毒的方法。其中混合硝酸纤维素膜法对病毒的富集效率最高,硝酸纤维素膜是一种阴离子膜,表面带有负电荷,为了把带负电荷的诺如病毒吸附到带负电荷的膜上,需要在过滤原水中加入多价阳离子,使病毒与阳离子结合,从而形成一个带正电荷的病毒-阳离子复合物,该复合物在过滤的时候就会被吸附到负电荷膜上,然后再利用少量碱性洗脱液将病毒从膜上竞争性的洗脱下来[6]。絮凝沉淀法是广泛使用的从水中富集诺如病毒的方法,通过调节pH值并向水中加入化学物质,形成絮凝沉淀,病毒与絮凝沉淀结合后通过离心或者抽滤进行回收。该方法操作简单,不过只能富集小体积的水样,当水样过多时絮凝沉淀容易滤膜堵塞。实践表明富集水样体积最好在1 L以内,而且当水样中病毒的浓度很低时,该种方法很难以从水中富集到足够检测量的病毒[4]。PEG沉淀法操作简单,不过每次富集的水样的体积小,且回收率较低,常常用来辅助其他富集方法,对富集后的病毒液进行二次浓缩。本研究发现,在絮凝沉淀法、阴离子膜法和PEG沉淀法3种方法中,阴离子膜法对水中诺如病毒的富集效果更好。
        近些年,阳离子膜法成为了研究的热点,带负电荷的病毒通过滤膜的时候可以直接被吸附到带正点的阳离子膜上,其最大的优点是可以富集大体积的水样,而且还不需要对水样进行前处理,不过已经报道的几种阳离子膜对病毒的富集率普遍较低。1980年,Sobsey等[9]开发了带有折叠滤芯的筒式过滤器,滤芯的膜上带有正电荷。20世纪90年代,Vilaginès等[10]开发的玻璃绒填充的滤器也获得了推广使用。在后期的工作中,寻找对病毒具有较强吸附,且可以从材料上高效的把病毒洗脱下来的新型阳离子材料是对病毒富集的研究热点。

参考文献
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