中华预防医学杂志    2017年05期 多环芳烃暴露工人外周血淋巴细胞组蛋白H3Ser10磷酸化修饰与DNA损伤的关系    PDF     文章点击量:257    
中华预防医学杂志2017年05期
中华医学会主办。
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王方萍 朱小年 章征保 陈丽萍 樊俊灵 黎青叶 陈燊 陈雯
WangFangping,ZhuXiaonian,ZhangZhengbao,ChenLiping,FanJunling,LiQingye,ChenShen,ChenWen
多环芳烃暴露工人外周血淋巴细胞组蛋白H3Ser10磷酸化修饰与DNA损伤的关系
The relationship between histone H3Ser10 phosphorylation and DNA damage in periphery blood lymphocytes of polycyclic aromatic hydrocarbons exposed workers
中华预防医学杂志, 2017,51(5)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.05.010

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投稿日期: 2016-12-19
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多环芳烃暴露工人外周血淋巴细胞组蛋白H3Ser10磷酸化修饰与DNA损伤的关系
王方萍 朱小年 章征保 陈丽萍 樊俊灵 黎青叶 陈燊 陈雯     
王方萍 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
朱小年 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
章征保 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
陈丽萍 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
樊俊灵 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
黎青叶 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
陈燊 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
陈雯 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系广州市环境污染与健康风险评价重点实验室
摘要: 目的  探讨多环芳烃(PAHs)暴露对焦炉作业工人外周血淋巴细胞(PBLCs)的组蛋白H3Ser10磷酸化修饰(p-H3S10)改变与DNA损伤效应之间的关系。方法  2014年采用整群抽样法选取辽宁省本溪市某钢铁厂75名焦炉作业工人作为PAHs暴露组,并以年龄、工龄、劳动强度和高温作业为匹配因素,选取当地50名热轧厂工人作为对照组,检测尿1-羟基芘(1-OHP)水平。采用彗星实验检测外周血淋巴细胞(PBLCs)DNA的损伤程度,测量彗星尾距(OTM)、彗星尾部DNA百分比(Tail DNA%),用ELISA分析特异组蛋白p-H3S10水平。采用简单线性回归模型分析组间人群PAHs暴露、DNA损伤程度和组蛋白p-H3S10水平的关联。采用bootstrap的方法进行中介效应分析,分析尿1-OHP、DNA损伤和组蛋白修饰之间的关联调控关系。结果  对照组和PAHs暴露组人群的年龄分别为(45.32±8.32)、(43.87±5.67)岁(P=0.284)。PAHs暴露组的组蛋白p-H3S10水平MP5~P95)[4.54(1.85~23.91)]高于对照组2.21(0.68~4.71)(P<0.001)。以暴露人群的尿1-OHP进行分组后发现,P0~P25P26~P50P51~P75P76~P100组蛋白p-H3S10水平分别为(2.59±1.19)%、(3.24±2.81)%、(5.55±3.25)%、(8.77±7.84)%(P趋势<0.001)。p-H3S10水平、OTM值、Tail DNA%与尿1-OHP均存在线性关联,β(95%CI)值分别为0.264(0.167~0.360)、0.500(0.299~0.702)、0.510(0.384~0.671)(P<0.001),且p-H3S10水平与OTM值和Tail DNA%呈正相关,β(95%CI)值分别为0.149(0.073~0.226)、0.220(0.132~0.308)(P值均<0.001)。DNA损伤对PAHs诱导p-H3S10修饰改变的中介效应值为0.054(P=0.040)。结论  PAHs暴露可致外周血淋巴细胞DNA损伤以及组蛋白p-H3S10修饰升高,组蛋白H3Ser10磷酸化修饰改变可能在调控细胞DNA损伤修复中起重要作用。
关键词 :DNA损伤;多环芳烃;1-羟基芘;p-H3S10
The relationship between histone H3Ser10 phosphorylation and DNA damage in periphery blood lymphocytes of polycyclic aromatic hydrocarbons exposed workers
WangFangping,ZhuXiaonian,ZhangZhengbao,ChenLiping,FanJunling,LiQingye,ChenShen,ChenWen     
Faculty of Preventive Medicine, School of Public Health, Sun Yat-sen University, Guangzhou Key Laboratory of Environmental Pollution and Health Risk Assessment, Guangzhou 510080, China
Corresponding author:Chen Wen,Email: chenwen@mail.sysu.edu.cn
Abstract:Objective  To investigate the effect of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) exposure on the level of histone H3Ser10 phosphorylation (p-H3S10) and DNA damage degree in peripheral blood lymphocyte (PBLCs).Method  75 coke oven workers from Benxi steel plant in Liaoning Province of China (PAHs-exposed group) and local 50 hot rolling workers (control group) were recruited in this study with age, working years, labor intensity and high temperature for matching factors using cluster sampling method in 2014. HPLC-fluorescence was performed to determine the level of urinary 1-hydroxypyrene (1-OHP), DNA damage and specific histone modification were measured in PBLCs of the subjects through comet assay and ELISA assay, respectively. Linear regression model analysis was used to analyze the differences among PAHs exposure, DNA damage and p-H3S10 level in two groups. The Mediation analysis was used to analyze the regulated relationships between urinary 1-OHP, DNA damage and histone modification through the bootstrap method.Results  Age of the control and the exposed group were (45.32±8.32) and (43.87±5.67) years old (P=0.284). The concentration of urinary 1-OHP, OTM value, Tail DNA% and p-H3S10 level in exposure group were higher than that in control group, while the M (P5-P95) of p-H3S10 levels in control and exposed group were 2.21 (0.68-4.71), 4.54 (1.85-23.91) (P<0.001). The degree p-H3S10 level was increased after the subgroups which were (2.59±1.19)%, (3.24±2.81)%, (5.55±3.25)%, (8.77±7.84)%, respectively, divided by quantitated 1-OHP concentration as P0-P25, P26-P50, P51-P75 and P76-P100 (P<0.001). We also found the correlations between urinary 1-OHP and p-H3S10 level or OTM value or Tail DNA%, β (95%CI) were 0.264 (0.167-0.360), 0.500 (0.299-0.702), and 0.510 (0.384-0.671), respectively (P<0.001). Similar result was also observed between p-H3S10 level and OTM value or Tail DNA%, β (95%CI) were 0.149 (0.073-0.226) and 0.220 (0.132-0.308) (P<0.001). Moreover, the mediation effect value of DNA damage on PAHs induced p-H3S10 alteration was 0.054(P=0.040).Conclusion  The results suggested that PAHs exposure could induce DNA damage and an increase in histone H3Ser10 phosphorylation in PBLCs. Particularly, the alteration of H3S10 phosphorylation may play an important role in regulating cell DNA damage repair.
Key words :DNA damage;Polycyclic aromatic hydrocarbon;1-Hydroxypyrene;H3Ser10 phosphorylation
全文

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是广泛存在的职业和环境污染物,国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)已将其列为人类Ⅰ类致癌物。尽管流行病学研究已经揭示,长期的PAHs暴露与焦炉工人肺癌的高发病率相关[1],然而相关机制尚未阐明。既往关于PAHs引起机体损伤的机制主要集中在遗传损伤,包括基因突变、DNA加合物和染色体畸变等[2]。然而,越来越多证据表明,表观遗传变异是PAHs诱导遗传毒性和致癌性的关键事件[3,4,5]。其中,组蛋白磷酸化修饰是一种重要的表观遗传模式,近年来特异的组蛋白修饰被认为可能作为应答化学物暴露和人群健康效应评价的生物标志物[6,7]
        组蛋白磷酸化修饰多集中在组蛋白游离N端的30个氨基酸上,最常见的是组蛋白H3的修饰。以往研究证实,组蛋白H3磷酸化在细胞周期、基因转录、DNA损伤修复等细胞事件中起作用[8,9,10]。本课题组前期研究发现,组蛋白H3Ser10磷酸化修饰(histone H3 phosphorylation at ser10,p-H3Ser10)可以通过直接调控DNA错配修复基因MutL同源体1(mutL homolog 1, MLH1)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose) polymerase 1, PARP1]基因的转录表达,从而影响黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)作用,诱导其发生DNA损伤修复以及细胞恶性转化进程,提示p-H3Ser10过程可能在调控外源化学物毒作用方面发挥重要作用[11]。然而,PAHs暴露是否影响组蛋白H3S10的磷酸化水平,以及PAHs诱导的损伤效应是否与其相关目前还未阐明。本研究选择焦炉厂PAHs暴露工人作为研究对象,检测PAHs暴露人群中外周血淋巴细胞H3S10的磷酸化水平以及其与内暴露水平、DNA损伤之间的关联,探讨组蛋白H3S10磷酸化修饰是否参与调控多环芳烃暴露引起的DNA损伤,为寻找PAHs暴露人群的早期生物监测指标提供理论依据。

对象与方法  

1.对象:  2014年采用整群抽样法选取辽宁省本溪市某钢铁厂75名焦炉作业工人作为PAHs暴露组,并以年龄、工龄、劳动强度和高温作业为匹配因素,选取当地50名热轧厂工人作为对照组。通过问卷调查的方法获得研究对象的基本情况,排除近3个月有X线照射、急性感染和患慢性病的人群。本研究经中山大学公共卫生学院伦理审查委员会审查(批号:中大公卫医伦[2013]第30号),研究对象均知情同意。

2.主要试剂:  1-羟基芘(1-Hydroxypyrene,1-OHP)标准品(纯度≥99. 0%)、18C色谱柱、碘化丙啶(购自美国Sigma公司);人外周血淋巴细胞分离液(购自中国天津灏洋生物制品科技有限责任公司);低熔点琼脂(购自美国Amresco公司);RIPA裂解液(购自中国碧云天生物技术)、兔抗H3-C端抗体(购自美国Sigma公司)、兔抗p-H3S10抗体(购自美国Millipore公司)。

3.组蛋白抽提及组蛋白p-H3Ser10修饰水平检测:  抽取研究对象的空腹肘静脉血5 ml,经密度梯度离心法分离淋巴细胞用于组蛋白抽提。组蛋白采用酸抽提方法,简要步骤包括:外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte cells,PBLCs)经RIPA裂解离心后,清洗液清洗沉淀,0.04 mol/L硫酸重悬后4 ℃过夜,次日收集上清,加预冷丙酮沉淀,-20 ℃过夜,收集沉淀,用适量去离子水溶解,定量后保存在-80 ℃。组蛋白p-H3Ser10水平检测:采用ELISA法检测组蛋白修饰水平,参照Arita等[7]的方法,用抗H3-C端抗体4 ℃包被96孔板过夜,质量分数5%脱脂牛奶封闭2 h后,加入标准品和样品孵育1.5 h,之后加入抗H3 (1∶10 000)和抗p-H3S10 (1∶1 000)摇动1 h,再加入二抗摇动1 h,然后滴加3,3'5,5'-四甲基联苯胺(3,3 5,5-Tetramethylbenzidine, TMB)显色液避光孵育0.5 h,用0.04 mol/L硫酸终止显色,酶标仪上450 nm波长检测吸光度,根据标准曲线算出样品浓度。

4.尿1-OHP检测:  工人班末尿1-OHP检测参考Jongeneelen等[12]建立的方法。尿样经β-葡糖苷酸酶水解、二氯甲烷萃取以及体积百分比为75%甲醇溶解后,采用高效液相色谱-荧光检测法进行分析:分离柱为18C(内径4.6 mm ×长度150 mm,填料粒径5 μm),流动相采用甲醇:水体积比为3∶1的混合液梯度洗脱15 min,流速1 ml/min,进样10 μl,荧光检测器:λex/λem= 346/386 nm。

5.彗星实验检测淋巴细胞DNA损伤:  参考Peng等[13]建立的方法,取外周血5 μl与200 μl质量分数为1%的低熔点琼脂糖混匀,取30 μl混匀液平铺到彗星预制胶板上。避光晾干30 min,4 ℃碱性裂解4 h,经过解旋、电泳、中和和脱水步骤后,用5 μg/μl的碘化丙啶避光染色,荧光显微镜下拍照记录。采用Comet Assay Software Project-1.2.2软件分析100个细胞的彗星尾距(Olive tail moment,OTM)和彗星尾部DNA百分比(Tail DNA%)。

6.统计学分析:  统计分析均采用SPSS 20.0软件。年龄、BMI、暴露时间符合正态分布,以±s表示,采用t检验进行两组间差异比较;尿1-OHP、p-H3S10、OTM和Tail DNA%为偏态分布,以MP5~P95)表示,经自然对数转换后进行组间t检验。依据尿1-OHP水平的四分位数,将暴露组调查对象分为P0~P25P26~P50P51~P75P76~P100四组;经自然对数转换后采用协方差和χ2趋势检验分析组蛋白p-H3S10、OTM和Tail DNA%在组间的差异;采用简单线性回归模型分析尿1-OHP与p-H3S10和OTM或Tail DNA%的相关性。参照文献[14],以bootstrap方法进行DNA损伤对PAHs诱导p-H3S10修饰改变的中介效应分析,bootsrap样本量选择5 000,模型为model 4。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.基本情况:  暴露组的PAH暴露时间为(16.03±7.20)年。两组人群的年龄、BMI指数、吸烟率和饮酒差异均无统计学意义(P>0.05),暴露组烧烤食物摄入频率高于对照组。暴露组人群的尿1-OHP浓度、组蛋白P-H3Ser10化水平和外周血DNA损伤程度都高于对照组工人(P<0.001)。详见表1

表1多环芳烃暴露组与对照组调查对象的基本特征比较

2.组蛋白p-H3S10水平与PAHs暴露的关系:  如表2所示,尿1-OHP浓度与组蛋白p-H3S10水平存在剂量-反应关系(P趋势<0.001)(表2)。简单线性回归模型结果表明,p-H3S10水平和PAHs暴露呈现正相关(表3)。当调整了影响尿1-OHP、DNA损伤和组蛋白修饰相关的年龄、吸烟、饮酒、烧烤食物摄入等因素后,相关关系依然存在[β(95%CI)值为0.264(0.167~0.360)]。以上结果说明,PAHs暴露与PBLCs的p-H3S10修饰关系密切,暴露程度越严重,p-H3S10水平越强。

表2不同尿1?羟基芘水平与DNA损伤指标、组蛋白p?H3S10水平的关系
表3采用简单线性回归模型分析尿1?羟基芘与DNA损伤指标的关系

3.PAHs暴露引起外周血淋巴细胞DNA损伤:  尿1-OHP水平与DNA的损伤程度呈现增强的趋势(P趋势<0.001);尿1-OHP浓度与DNA损伤水平正相关[β(95%CI)值分别为0.500(0.299~0.702)、0.510(0.384~0.671)](表3),证实PAHs暴露会诱导DNA损伤,并具有剂量-反应关系。

4.p-H3S10异常修饰与DNA损伤程度有关:  建立组蛋白p-H3S10水平与DNA损伤的简单线性回归模型(表4),发现组蛋白p-H3S10水平与DNA损伤的两个指标之间同样存在线性相关,表明DNA损伤越严重,p-H3S10水平越高,提示DNA损伤可能诱导组蛋白H3S10发生异常的磷酸化修饰。

表4采用简单线性回归分析组蛋白p?H3S10与DNA损伤的关系

5.DNA损伤可能诱导组蛋白修饰改变:  上述结果表明,PAHs内暴露指标尿1-OHP、DNA损伤和组蛋白p-H3S10三者相关。DNA损伤的中介效应差异有统计学意义(P=0.040),且中介效应值为0.054,控制了中介变量彗星尾部DNA百分比后,尿1-OHP对p-H3S10的影响有统计学意义(β=0.252,P<0.001),说明DNA损伤在PAHs暴露引起p-H3S10改变中发挥中介作用,但并非是完全中介效应,只是部分中介效应。

讨论  焦炉工肺癌是我国八大职业肿瘤之一,流行病学研究发现,在生产炼焦过程产生的焦炉逸散物中所含的大量PAHs是焦炉工肺癌发生的主要原因之一[15,16,17]。近年来,环境有害因素、遗传和表观遗传的交互作用在介导人群健康损伤效应方面的研究,已成为毒作用机制研究的重要领域。越来越多研究证实,表观遗传修饰异常在化学致癌和化学物危险度评价中发挥重要作用。因此,探讨PAHs暴露人群中特异的组蛋白修饰有助于寻找环境暴露和早期效应生物标志物,以及阐明PAHs暴露相关疾病的机制。本研究发现PAHs暴露不仅可致外周血淋巴细胞DNA损伤,还会引起组蛋白p-H3Ser10水平升高。
        表观遗传模式改变是环境有害因素发挥毒作用过程中的重要分子事件。以往研究表明钢铁厂工人在长期暴露于富含金属的颗粒物后,其外周血淋巴细胞中的H3K4me2和H3K9ac水平升高[18],在砷暴露人群中也发现了H3K9me2和H3K9ac修饰水平与环境砷浓度有密切联系[19],说明特异组蛋白修饰改变与环境化学物暴露密切相关。本课题组以往也发现PAHs暴露可引起外周血淋巴细胞H3K4/27/36me3修饰改变[20],与之相一致的是,本研究也发现p-H3S10水平与PAHs暴露相关,提示组蛋白p-H3Ser10可能参与PAHs暴露引起的早期机体反应。
        迄今为止,关于在外源化学物刺激下引发特异组蛋白修饰改变的机制还未完全阐明。有报道指出,环境化学物可直接影响组蛋白的甲基化酶和去乙酰化酶,比如镍暴露会影响赖氨酸特异性去甲基化酶3A(lysine demethylase 3A,KDM3A)的活性从而降低H3K9me2的水平[21]。此外,组蛋白的其他修饰比如甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化改变会直接影响DNA损伤修复的效率[22,23,24,25],本课题组前期研究揭示了组蛋白H3K36me3参与PAHs暴露诱导的DNA损伤修复相关基因(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)和MLH1的表达调控[19]。还有证据显示,组蛋白p-H3Ser10在X线照射后细胞的G1期伴随γ-H2AX的升高有降低的趋势,其机制与抑制转录和促进DNA损伤修复有关[26]。以上研究表明组蛋白修饰改变在化学物发挥毒效应中起着关键作用。本研究中,PAHs暴露水平、组蛋白p-H3Ser10以及DNA损伤三者之间均存在同向的线性关联,符合Mediation分析条件。中介效应是指变量间的影响关系(X?Y)不是直接的因果链关系而是通过一个或一个以上变量(M)的间接影响产生的,此时我们称M为中介变量,而X通过M对Y产生的间接影响称为中介效应,Mediation分析成立的条件是所分析的三者之间均存在同向的线性关联,在两者之间建立线性模型后,加入第三者后其前面两者的线性关系不存在或减弱,那么这第三个因素就可能是其中间的桥接因素。在尿1-OHP与p-H3S10之间建立线性模型后,加入Tail DNA%后前面两者的线性关系依然存在,说明DNA损伤属于不完全中介效应,即H3Ser10的磷酸化修饰改变很可能部分是由DNA损伤所诱导,不排除PAHs暴露可能直接亦或是通过其他方式引起p-H3S10水平的升高。我们在转化细胞模型中发现蛋白磷酸酶2A活性下降导致H3S10磷酸化修饰水平增加,而PP2A直接结合并调控p-H3S10水平,影响AFB1诱导的DNA损伤修复以及细胞恶性转化[11]
        综上所述,本研究揭示了PAHs暴露可引起PBLCs的组蛋白p-H3Ser10水平升高,并且推测部分可能由DNA损伤所诱导,但深入机制研究还有待阐述。本研究不仅拓展了对表观遗传和遗传损伤之间关系的认识,还为PAHs暴露的早期疾病监测提供新的候选指标。

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