中华预防医学杂志    2017年08期 佛山顺德区居民IL6及IL10单核苷酸多态性与原发性肝癌遗传易感性的关联分析    PDF     文章点击量:258    
中华预防医学杂志2017年08期
中华医学会主办。
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王小丽 叶新 于新发 丁鸿 刘渠 刘丽 陈思东
WangXiaoli,YeXin,YuXinfa,DingHong,LiuQu,LiuLi,ChenSidong
佛山顺德区居民IL6及IL10单核苷酸多态性与原发性肝癌遗传易感性的关联分析
The association between single-nucleotide polymorphisms in IL6, IL10 genes and the susceptibility to primary hepatic carcinoma in Shunde District of Foshan City
中华预防医学杂志, 2017,51(8)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.08.008

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投稿日期: 2017-04-18
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佛山顺德区居民IL6及IL10单核苷酸多态性与原发性肝癌遗传易感性的关联分析
王小丽 叶新 于新发 丁鸿 刘渠 刘丽 陈思东     
王小丽 518172 深圳市龙岗区疾病预防控制中心技术质量管理科
叶新 广州市天河区疾病预防控制中心疾病预防控制科
于新发 佛山市顺德区第一人民医院肿瘤科
丁鸿 518172 深圳市龙岗区疾病预防控制中心技术质量管理科
刘渠 深圳市龙岗区疾病预防控制中心
刘丽 广东药科大学公共卫生学院
陈思东 广东药科大学公共卫生学院
摘要: 目的  分析广东顺德地区居民IL6及IL10单核苷酸多态性与原发性肝癌遗传易感性的关联。方法  选择2010年10月至2012年10月就诊于佛山顺德区两家医院患者。病例组纳入标准:原发性肝癌;顺德本地居民或在顺德当地居住10年及以上。对照组纳入标准:与病例组患者同期在同院于耳鼻喉科、普外科和体检科就诊的病例;顺德本地居民或在顺德当地居住10年及以上;依据病例组患者的性别、诊断时年龄(±3岁)进行1∶1匹配。共收集病例和对照组对象各306例。采用问卷对患者进行调查,内容包括:人口学特征、原发性肝癌状况调查等。并采集静脉血后提取DNA,选择SNP位点并检测基因型。采用拟合优度χ2检验验证对照组人群基因型分布是否存在Hardy-Weinberg平衡;采用多因素条件logistic回归模型分析rs1800796、rs1800871和rs1800872位点基因多态性与原发性肝癌遗传易感性的关系。结果  病例组和对照组的男性均为264例,女性均为42例,年龄分别为(55.84±11.49)和(55.83±11.67)岁。对照组的IL6(rs1800796)、IL10(rs1800871)和IL10(rs1800872)基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡(P值均>0.05),即研究人群具有代表性。调整吸烟史,进食鱼生史,饮酒史,慢性乙肝感染和肝癌家族史等因素后,与携带IL10(rs1800872)位点AA基因型相比,携带CC基因型的个体患肝癌的风险增加2.02倍(OR=3.02,95%CI:1.21~7.56);与携带AA+AC基因型相比,携带CC基因型的个体罹患肝癌风险增加1.89倍(OR=2.89,95%CI:1.19~7.04)。IL6(rs1800796)单核苷酸多态性与原发性肝癌遗传易感性的关联无统计学意义(P>0.05)。结论  携带IL10(rs1800872) CC基因型个体罹患原发性肝癌风险增加。
关键词 :肝肿瘤;病例对照研究;多态性,单核苷酸
The association between single-nucleotide polymorphisms in IL6, IL10 genes and the susceptibility to primary hepatic carcinoma in Shunde District of Foshan City
WangXiaoli,YeXin,YuXinfa,DingHong,LiuQu,LiuLi,ChenSidong     
Longgang Center for Disease Control and Prevention of Shenzhen, Shenzhen 518172, China
Corresponding author: Chen Sidong, Email: chensidong@tom.com
Abstract:Objective  To investigate the association between single nucleotide polymorphisms (SNP) in cytokine IL6, IL10 genes and the susceptibility to primary hepatic carcinoma(PHC) of Shunde district in Guangdong Province.Methods  Patients from two hospitals in Shunde District of Foshan City were selected from October 2010 to October 2012. Case group inclusion criteria includedprimary liver cancer; local residents of Shunde or living in Shunde for more than 10 years. The control group inclusion criteria included: patients visited ENT, general surgery and physical examination department in the same hospital during the same period; Local residents or living in Shunde for 10 years and above. The control group was matched 1∶1 by gender, and age (±3 years old) with case group. A total of 306 subjects were collected. Questionnaires were used to investigate the information including demographic characteristics, PHC status survey and so on. The venous blood was collected from each subject to extract DNA, and to detect label SNP site and genotype. Hardy-Weinberg equilibrium was detected in the control group by the goodness-of-fit χ2 test. Multivariate conditional logistic regression was used to estimate the relationship between IL6 (rs1800796), IL10 (rs1800871, rs1800872)genes polymorphisms and susceptibility to PHC.Results  There were 264 males and 42 females both in the case group and the control group, with an average age of (55.84±11.49) and (55.83±11.67) years old respectively (t=0.011, P=0.992). The frequencies of IL6 (rs1800796), IL10 (rs1800871) and IL10 (rs1800872) genotypes in the control group were in accordance with the Hardy-Weinberg equilibrium, which indicated the population was representative (all P values>0.05). Conditional logistic regression analysis showed that compared with the AA genotype and AA+AC genotype of IL10(rs1800872), CC genotype increased the risk of PHC by 2.02 times (OR=3.02, 95%CI:1.21-7.56)and 1.89 times (OR=2.89, 95%CI:1.19-7.04)respectively after the smoking history, eating fish history, drinking history, chronic hepatitis B infection, and family history of liver cancer adjusted. No statistical association was found between SNP in cytokine IL6 (rs1800796) and the susceptibility to PHC (P>0.05).Conclusion  The results indicated that people who carried CC genotype in rs1800872 of IL10 gene have an increasing risk of PHC.
Key words :Liver neoplasms;Case-control studies;Polymorphism, single nucleotide
全文

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma, PHC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,居全球癌症死因的第2位[1]。广东顺德地区居民肝癌死亡率高居癌症死因顺位的第一位,其肝癌年平均死亡率仅次于江苏省启东市、广西壮族自治区扶绥县[2],成为严重影响当地居民身心健康的重大疾病。既往的研究结果表明个体的遗传背景差异与肝癌的发病风险有关[3]。已有相关研究结果提示一些基因特定区域单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与肝癌的易感性有关[4,5]。IL6和IL10基因同属于炎症因子的家族成员,作为炎症反应的重要因子参与肝组织免疫病理过程。位于IL6和IL10启动子区的SNP可影响转录和翻译,在肝癌发生发展过程中起着重要作用[6,7]。本研究选取IL6和IL10基因启动子区的3个位点,分别分析其与原发性肝癌遗传易感性的关系。

对象与方法  

1.对象:  本研究采用以医院为基础的病例-对照研究。研究对象来源于2010年10月至2012年10月就诊于佛山顺德区某2家医院的患者。(1)病例组纳入标准:依据《原发性肝癌的临床诊断与分期标准诊断》[8]诊断为原发性肝癌的病例;顺德本地居民或在顺德当地居住10年及以上。(2)对照组纳入标准:与病例组患者同期在同院于耳鼻喉科、普外科和体检科就诊的病例;顺德本地居民或在顺德当地居住10年及以上;依据病例组患者的性别、诊断时年龄(±3岁)等特征进行1∶1匹配。(3)病例组和对照组排除标准:患有精神失常及既往肿瘤病史者。共收集病例和对照各306例。本研究已通过广东药科大学伦理委员会的批准[批号:(2013)临审(04号)]。所有研究对象均签署了知情同意书。

2.问卷调查:  本研究采用自行设计的流行病学调查问卷。问卷内容包括:一般情况、PHC状况调查、既往肝病史、既往慢性疾病史、个人生活习惯、家族史、职业史和居住史等。调查问卷由经过培训合格的调查员,与研究对象进行面对面的访谈。

3.血样采集和DNA提取:  所有研究对象均采集肝素钠抗凝和非抗凝静脉血各5 ml,采集到的血样标本24 h内在4 ℃下进行离心分离血浆和血细胞,DNA提取前置-80 ℃保存。DNA提取使用的是中国天根血液基因组DNA提取试剂盒(批号:DP318-03)。

4.SNP位点选择及基因分型:  本研究SNP位点的选择是根据查阅文献资料,以及最新的中国北京汉族人群的基因分型结果及相关数据[9],且最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>0.05的标准,最终选取IL6-572位点的rs1800796,IL10-819位点的rs1800871和IL10-592位点的rs1800872,均位于启动子区(SNP具体信息见表1)。使用美国Bio-rad(mini option)型实时荧光定量PCR仪,采用TaqMan荧光定量PCR的方法检测候选位点的基因型。实验使用的DRR390-Premix Ex Taq酶,由大连宝生物工程有限公司生产;TaqMan MGB探针与引物,由上海基康公司合成(探针与引物信息见表2)。PCR反应体系:20 μl,包含Premix 10 μl,上下游引物各0.2 μl,两条探针各0.2 μl,DNA模板1 μl和双蒸水8.2 μl。PCR扩增条件:预变性95 ℃ 30 s,95 ℃变性30 s, 54~60 ℃退火30 s,72℃延伸30 s,共44个循环。基因分型结果利用CFX Manager2.0软件进行读取。

表1IL6和IL10基因SNP位点基本信息
表2IL6和IL10基因SNP位点探针与引物信息

5.质量控制:  本研究所收集的调查表有专人负责质量控制,调查表内容经质控人员核实无误后建立数据库,数据采用双录入,进行一致性检验同时进行数据清洗以保证数据的准确性。DNA提取过程严格遵循无菌操作的要求,并避免血样反复冻融,减少DNA的降解,PCR过程中每次实验均设置5%的平行样本及2个阴性对照和阳性对照以验证实验结果的准确度和可靠性,检测结果一致性达100%。

6.统计学分析:  采用Epidata 3.0建立问卷数据库;患者年龄分布符合正态分布,用±s表示;利用t检验比较病例组和对照组的年龄差异;采用χ2检验比较病例组和对照组基本特征差异;采用拟合优度χ2检验验证对照人群基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;采用多因素条件logistic回归模型,分析rs1800796, rs1800871和rs1800872位点基因多态性与原发性肝癌遗传易感性的关系,以P<0.05为差异有统计学意义。用Bonferroni检验调整对不同位点进行分析并对分层分析的多重检验进行调整,以P=0.017(0.05/3)为差异有统计学意义。所有统计分析均在SAS 9.3软件完成。

结果  

1.基本情况:  病例组和对照组男性均为264例,女性均为42例,年龄分别为(55.84±11.49)和(55.83±11.67)岁(t=0.011,P=0.992)。病例组和对照组对象吸烟史、饮酒史、进食鱼生史、慢性乙肝史、原发性肝癌家族史差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3

表3佛山顺德区原发性肝癌病例组和对照组基本情况比较

2.IL6和IL10基因各基因型分布频率:  Hardy-Weinberg平衡和各基因型的分布检验:对照组的IL6(rs1800796)、IL10(rs1800871)和IL10(rs1800872)基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡(P值分别为0.052、0.156、0.224),即研究人群具有代表性。IL6和IL10基因各基因型在病例组与对照组中的分布差异均没有统计学意义(P>0.05)。详见表4

表4佛山顺德区原发性肝癌病例组和对照组人群IL6及IL10基因各基因型比较[n(%)]

3.IL6和IL10基因SNP与原发性肝癌的多因素分析:  在调整吸烟史,进食鱼生史,饮酒史,慢性乙肝感染和肝癌家族史等因素后,与携带IL10(rs1800872)位点AA基因型相比,携带CC基因型的个体患原发性肝癌的风险增加2.02倍(OR=3.02,95%CI:1.21~7.56);与携带AA+AC基因型相比,携带CC基因型的个体罹患原发性肝癌风险增加1.89倍(OR=2.89,95%CI:1.19~7.04),经Bonferroni检验调整以P=0.017为显著水准时,差异没有统计学意义。详见表5

表5IL6和IL10基因SNP与原发性肝癌的多因素logistic回归模型分析

讨论  既往的研究表明,大量的IL6能激活STAT信号通路,维持炎性微环境,间接促进肝癌的发展,位于启动子区的基因多态性能影响IL6转录,与肝癌、前列腺癌、乳腺癌等疾病患者IL6水平的特征性升高密切相关[10]。仇小强等[11]的研究发现IL6-572C/G位点SNP与广西地区人群的慢性乙肝感染有关,携带GG基因型个体患慢性乙肝感染的风险是携带CC基因型2.17倍。携带IL6-572位点的GG/GC基因型的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)携带者相比CC基因型,患肝癌的风险并无增加。此外,Park等[7]的研究得出不一致的结论:认为IL-6基因多态性并不会影响慢性HBV感染者向肝硬化和肝癌进展,IL6-572C/G基因型在慢性乙肝感染患者与肝硬化者之间以及HBV感染所致的肝癌患者与慢性HBV感染的非肝癌患者之间的分布频率差异没有统计学差异。
        IL10有很强的抗炎以及抑制细胞免疫的作用,IL10的表达可以作为展示肝损害和肝组织炎症坏死程序的指标,其表达与否在病理和生理上都有着重要意义。Shin等[12]的研究通过关联分析得出在乙肝患者中,IL10的一种单体型IL10-HT2水平与肝癌的发生率显著相关。有聚类分析[13]的结果显示:在亚洲人群中,IL10-592A/C的基因多态性可能与肝癌患病风险有关,而IL-10-819T/C基因多态性与肝癌患病风险无关。刘道洁等[14]的研究得出IL10启动子区基因多态性与HBV感染所致的肝脏损伤和重型肝炎的发生可能有关的结论。也有研究得出不同的结论,认为IL10启动子区基因多态性对IL10的表达水平无影响[15]。仇小强等[11]对广西地区人群的研究结果显示IL10基因-819位点TT基因型个体罹患肝癌的风险增加,IL10-592位点AA基因型个体罹患肝癌的风险降低。武俊香与贾因棠[16]的研究结果显示IL10-1082的A等位基因及AA基因型与乙肝病毒感染以及感染后的转归有关。
        本研究分析广东顺德地区人群细胞因子IL6和IL10基因SNP与原发性肝癌遗传易感性的关系,结果发现IL6基因SNP与原发性肝癌的关联未呈现统计学意义,而IL10基因SNP可能在原发性肝癌的发生发展过程中具有重要作用,携带IL10(rs1800872) CC基因型个体罹患原发性肝癌风险增加。考虑到原发性肝癌是一种由环境因素和遗传因素共同作用的复杂疾病,异质性可能由一些其他因素引起[17]。且本研究样本量相对较小,经Bonferroni检验调整以P=0.017为显著水准时,差异没有统计学意义。调查问卷和研究设计上面仍存在缺陷,因此后续研究可以考虑增大样本量,进行基因-基因,基因-环境交互作用分析,进一步探究遗传因素在原发性肝癌发生发展中的作用。

参考文献
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