中华预防医学杂志    2017年08期 高通量测序技术在临床诊治遗传性肿瘤中的应用与研究进展    PDF     文章点击量:352    
中华预防医学杂志2017年08期
中华医学会主办。
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何佳雪 姜艳芳
HeJiaxue,JiangYanfang
高通量测序技术在临床诊治遗传性肿瘤中的应用与研究进展
The progress and prospect of application of genetic testing technology-based gene detection technology in the diagnosis and treatment of hereditary cancer
中华预防医学杂志, 2017,51(8)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.08.022

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投稿日期: 2017-05-10
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高通量测序技术在临床诊治遗传性肿瘤中的应用与研究进展
何佳雪 姜艳芳     
何佳雪 130021 长春,吉林大学第一医院基因诊断中心
姜艳芳 130021 长春,吉林大学第一医院基因诊断中心
摘要: 遗传性肿瘤由特定致病基因突变所致,早发现、早干预是防控遗传性肿瘤最有效的方法。高通量测序等基因检测技术突破了系谱分析对家系的限制,为遗传性肿瘤的诊治提供了便捷、高效的途径。本文通过简要介绍遗传性肿瘤的发生机制,总结高通量测序技术在遗传性视网膜母细胞瘤、遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征、遗传性结直肠癌等常见遗传性肿瘤和复杂及罕见遗传性肿瘤诊治中的应用,探讨了高通量测序技术的发展,并对其应用前景进行展望。
关键词 :肿瘤;高通量核苷酸测序;精准医学
The progress and prospect of application of genetic testing technology-based gene detection technology in the diagnosis and treatment of hereditary cancer
HeJiaxue,JiangYanfang     
Genetic Diagnosis Center, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China
Corresponding author: Jiang Yanfang, Email: yanfangjiang@hotmail.com
Abstract:Hereditary cancer is caused by specific pathogenic gene mutations. Early detection and early intervention are the most effective ways to prevent and control hereditary cancer. High-throughput sequencing based genetic testing technology (NGS) breaks through the restrictions of pedigree analysis, provide a convenient and efficient method to detect and diagnose hereditary cancer. Here, we introduce the mechanism of hereditary cancer, summarize, discuss and prospect the application of NGS and other genetic tests in the diagnosis of hereditary retinoblastoma, hereditary breast and ovarian cancer syndrome, hereditary colorectal cancer and other complex and rare hereditary tumors.
Key words :Neoplasms;High-throughput nucleotide sequencing;Precision medicine
全文

精准医学是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速发展以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。其本质是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术,对大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用,从而精确寻找到疾病病因和治疗的靶点,并对一种疾病的状态和过程进行精确分类,最终实现对疾病和特定患者进行个体化精准治疗的目的,提高疾病诊治与预防的效益。美国医学界在2011年首次提出了"精准医学"的概念,2015年美国总统奥巴马在国情咨文演讲中宣布了新的项目计划:精准医疗计划。随后,包括中国在内的各国宣布进入精准医学时代。
        精准医学是多学科、多技术交叉的学科,涉及的技术包括高通量测序技术、芯片技术、核型分析技术等。其中,高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS),是实现精准医学研究与应用的基础和技术前提,NGS能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,可用来解决多种生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序,获得该物种的参考序列,为后续研究和分子育种奠定基础。对有参考序列的物种进行全基因组重测序,在全基因组水平上扫描并检测突变位点,是发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序,从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(coding single nucleotide polymorphism,cSNP)等研究;进行小分子RNA测序,通过分离特定大小的RNA分子进行测序,从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上,与染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP)技术相结合,从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。
        基因检测技术,特别是NGS使遗传性肿瘤的筛查和检测成为可能,不仅可将其用于单基因及多基因突变导致的遗传性肿瘤的筛查与检测,也可用于未知病因或病因复杂的遗传性、家族性肿瘤的研究和临床检测,并对复杂和罕见肿瘤的发生风险在一定程度上做出评估。通过检测与遗传性肿瘤相关的基因并建立相应的数据库,有利于发现新的致病基因,提高早期发现肿瘤的可能,使肿瘤的预防更精准,更有效。

一、遗传性肿瘤发生的可能机制  肿瘤在本质上是一种基因性疾病,其发病机制受遗传和环境因素的影响。虽然大多数癌症病例是由于体细胞突变引起,但高达10%的肿瘤是由种系突变导致的[1]。在呈家族聚集性的肿瘤中,相同的生活环境虽然在肿瘤的发生过程中起到了一定作用,但遗传因素往往是家族中肿瘤高发的重要原因。肿瘤发生的遗传学背景包括单基因突变和多基因突变。人类恶性肿瘤中只有少数种类是按单基因方式遗传的,这些单基因遗传肿瘤的特点是发病年龄轻并且呈双侧发生或多发性,例如遗传性视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、Wilm瘤和嗜铬细胞瘤等,均以常染色体显性方式遗传(autosomal dominant,AD)。有部分单基因遗传病属于遗传性肿瘤范畴,遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X性连锁遗传。多基因遗传的肿瘤大多是一些常见的恶性肿瘤,如遗传性乳腺癌、胃癌等,患者的一级亲属的发病率显著高于群体的发病率。
        肿瘤的"二次打击学说"认为,遗传性肿瘤是由于第一次突变发生于生殖细胞或由父母遗传而来,所以该个体的所有体细胞实质都是潜在的前癌细胞,任何体细胞发生第二次突变就会转化为肿瘤细胞,因此这种肿瘤发生具有家族性、多发性、双侧性和早发性的特点。而非遗传性肿瘤是由于第一次突变发生在某个成体的体细胞中,只影响到来自这个体细胞增殖的细胞克隆,成为前癌细胞,如果这个体细胞及其克隆发生第二次突变即可形成肿瘤,故非遗传性肿瘤发病较迟[2,3,4]。成年人的遗传性肿瘤发病的中位年龄要比散发性肿瘤早15~20年,这种规律符合"二次打击学说"。
        还有一些患者有肿瘤家族史,多位亲属罹患肿瘤,但类型各不相同,一方面是由于有些肿瘤具有综合征的表现,如林奇综合征(Lynch syndrome,Lynch),还有一方面是由于遗传因素在肿瘤发病中仅表现出"易感性"的缘故。
        肿瘤的遗传易感性取决于种系突变以及遗传等位基因的外显率,可以分为高度、中度和低度三种。外显率高的等位基因常见于孟德尔常染色体显性遗传的肿瘤类型[5],导致个体罹患肿瘤的风险是普通人的10倍以上。如在BRCA1和BRCA2基因遗传史的家族中,20%携带突变的亲属患乳腺癌的风险是普通人的2倍以上[6]。同样,约5%的结肠、直肠癌与等位基因(如APC,MLH1或MSH2)的生殖细胞高外显率突变有关。通过这种方式遗传的癌症主要是由于抑制基因的功能丧失,而不是致癌基因的激活所致[7]
        具有中度或中等外显率的等位基因将疾病的平均风险增加了约2~5倍。虽然中等外显率等位基因在大多数人群中相对罕见,但在相对隔离的群体或受创始者效应[8]影响的紧密血缘关系的群体中相对常见。通过检测这类基因通常可以确定受影响的亲属,但其不完全外显性可能会导致隔代遗传,并可能危及整个家系。
        低外显率等位基因主要通过全基因组关联研究发现,可导致携带者罹患肿瘤的风险略高于普通人。多基因模型可解释这种现象,多个可小幅增加患癌症风险(1.5~2.0倍)的等位基因通过加法和乘法效应使患癌的敏感性增加,在此模型中,携带的等位基因数量与患癌症风险相关,数量少的风险较低,而数量多的风险可能高达50%[9]

二、精准医学时代遗传性肿瘤的研究方法  美国国立癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)认为,精准医学是将个体疾病的遗传学信息用于指导其诊断和治疗的医学。其中关键词之一是遗传学信息。精准医学时代,新型检测技术的出现提供了更多、更有优势的检测方法,其中一种重要检测技术即NGS。随着研究的日益深入,NGS在遗传性肿瘤中的重要性也逐渐突出。
        传统遗传性肿瘤的主要诊断方法为"系谱分析",通过对某遗传性患者家族各成员的发病情况进行详细调查,再以特定的符号和格式绘制反映家族各成员相互关系和发病情况的图谱。家族成员的发病情况是诊断遗传性肿瘤的重要依据。随着我国计划生育政策的实行,大的家系越来越少,独生子女家庭的小家庭模式使得系谱绘制难以进行[10]。加之有些肿瘤由于外显率的限制,在家族可追溯的成员中发病率较低,为通过系谱分析和遗传咨询判断遗传史及家族史增加了难度,因此只能通过分子生物学技术进行检测。
        NGS可以对有遗传史或家族中有遗传性肿瘤患者的"高危人群"有的放矢地进行基因检测,通过检测是否携带遗传性肿瘤的致病突变基因评估其患同种或其他遗传性肿瘤的风险。这种技术同样适用于无肿瘤家族史的"健康人群",这些"健康人群"包括通过基因检测未发现携带与遗传性肿瘤致病性相关的突变人群,以及那些携带了致病基因,但家族中无肿瘤患者,受检者自身也未意识到具有患癌风险的人群。因此,具有更为广阔的受益面。

三、NGS等基因检测技术在常见遗传性肿瘤研究与检测中的应用  在遗传性肿瘤致病原因研究过程中需综合考虑许多潜在的病因机制,包括传统的常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、中低度外显易感等位基因以及复杂的基因间、基因与环境间相互作用等[11]

1.NGS等基因检测技术在单基因遗传性肿瘤的研究与检测中的应用:  遗传性视网膜母细胞瘤是遗传性肿瘤中最为常见的单基因遗传性肿瘤之一,呈常染色体显性遗传。RB基因定位于13q14,共27个外显子,编码RB蛋白。RB蛋白是人体所有细胞生长、癌变的主要调控者,主要作用是抑制细胞生长、癌变,促进发育和分化。RB1基因突变可导致RB1蛋白失去活性,视网膜母细胞瘤是由于蛋白的频繁删除和无意突变所致[12]。至今已确定多种RB1基因突变可导致可遗传性视网膜母细胞瘤的发生[13,14]。虽然疑似的热点基因突变已被确定,但这些热点突变只占全部突变的40%,其余突变可见于整个RB1基因,最常见的是9、10、14、17、18、20和23号外显子上的突变,95%的RB1基因突变可被检出[14]。确认RB1基因突变对于降低医疗支出具有重要意义,因此关于RB1的基因突变检测也受到了重视,可以此技术筛查出有高RB1突变风险的儿童。何明燕等[15]应用多重PCR测序技术检测了35例RB患儿的RB1基因突变情况,发现14例(40%)患者具有RB1的胚系突变,提出对散发的单眼或双眼RB患者进行RB1胚系突变序列分析可以鉴定其是否为遗传型病例。目前,依托NGS的RB1基因突变检测已在临床开展[16]。吉林大学第一医院基因诊断中心通过对一例左眼白暗、疑似视网膜母细胞瘤的患儿进行RB1基因检测,发现患儿RB1基因的1~27号外显子缺失,此突变为已知致病突变。对其父母进行突变验证发现父母均未携带相同突变,家族中未发现类似病患,判断此患儿可能是由于新发突变患病。

2.NGS等基因检测技术在多基因遗传性肿瘤的研究与检测中的应用:  (1)遗传性乳腺癌/卵巢癌:"朱莉效应"提高了人们对遗传性乳腺癌以及遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征的认识[17]。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,多数乳腺癌呈散发性,约5%~10%的乳腺癌具有遗传易感性,表现为家族聚集性,且发病多小于50岁。BRCA1、BRCA2基因突变引起约60%的遗传性乳腺癌,而且是遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征目前已知的唯一因素[18]。在一般人群中,乳腺癌和卵巢癌终生发病风险分别约为13%和1.5%,而BRCA1、BRCA2突变携带者患乳腺癌的风险均高达40%~85%,患卵巢癌的风险分别是25%~65%和15%~20%。虽然BRCA1、BRCA2基因的突变根据人种不同存在差异,但美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)2016第2版的遗传性乳腺及卵巢癌综合征检测标准建议对于有家族史的人群应检测其BRCA1、BRCA2基因,对于携带已知致病性突变的人群应加强健康管理,以做到肿瘤预防和早期发现[19]。除BRCA1、BRCA2以外,还发现有一些基因与遗传性乳腺癌和卵巢癌的发病相关,如PALB2、BRIP1、TP53、PTEN、STK11、CDH1、ATM、BARD1D、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2[20]。多项研究表明,3%~4%的高风险个体在BRCA1和BRCA2以外的癌症风险基因(包括ATM,CHEK2,PALB2,PTEN,TP53等)中具有生殖细胞系的致病突变[21]。Crawford等[22]应用NGS检测了与乳腺癌和卵巢癌有关的ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、NBN、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11和TP53基因,并发现这些基因的突变与遗传性乳腺癌和卵巢癌之间存在相关性。随着技术的成熟与认识的提高,基因检测逐渐成为遗传性乳腺癌和卵巢癌预防和检测中不可或缺的一部分,NCCN指南已建议了有家族史的人群进行基因检测,以进行早期发现和干预。虽然在亚洲等国家遗传性肿瘤的管理与西方相比仍处在起步阶段,但取得了一定成效[20]。目前,针对遗传性乳腺癌和卵巢癌的基因检测主要分为两种,即只检测BRCA1、BRCA2,以及除检测BRCA1、BRCA2外同时检测多种已知与遗传性乳腺癌和卵巢癌相关的基因。在临床使用时,可根据患者的实际情况和需求进行检测。(2)遗传性结直肠癌:遗传性结直肠癌是另一种具有遗传性的肿瘤,包括遗传性非息肉性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和遗传性结肠息肉病[23]。HNPCC又被称为Lynch,是常染色体显性遗传病,主要由错配修复基因(mismatch repair gene,MMR)的突变引起[24]。Lynch阳性者患大肠癌、胃癌、子宫内膜癌等多种肿瘤的风险增高,其中患大肠癌的风险高达80%,是最常见的一种遗传性大肠癌综合征。约50%甚至更多符合临床诊断的患者或家系无法找到明确的分子致病机制,分子诊断是确诊Lynch的最有效方法。2004年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)的百慕大标准修订版制定了结直肠癌人群的微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)筛查标准,但是随着对Lynch和MMR基因的深入研究,为了减小遗漏筛查人群的可能,美国胃肠病学会于2015年颁布的最新指南推荐,对于所有初诊结直肠癌患者均应进行微卫星状态的检测[25]。由于约95%的Lynch和10%~15%散发的结直肠癌患者肿瘤组织均呈MSI状态,因此对于初筛为MSI的人群,还应进行胚系MMR基因检测予以明确诊断是否为Lynch。此外,对于MHL1免疫组织化学表达阴性的结直肠癌可先进行BRAF基因和(或)MLH1启动子甲基化的检测。如BRAF基因突变或MLH1过度甲基化,提示其MSI表型是由体系突变所致。Lynch基因检测在美国已大规模开展。通过检测,美国结直肠癌的发病率从1975年的60.5/10万降到2005年的46.4/10万,在1990—2007年间,结直肠癌的死亡率降低了大约35%。美国癌症联合委员会(American Joint Committeeon Cancer,AJCC)建议所有的大肠癌患者入院后均应做Lynch基因检测,阳性患者直系亲属做相应的MMR基因检测,对于遗传了基因突变的亲属及时给予健康干预,做到早预防、早治疗。
        除目标区域捕获法进行特定的遗传性肿瘤研究和检测及多种遗传性肿瘤的基因检测以外,全外显子或全基因组检测也可用于遗传性肿瘤或其他检测。尤其是全外显子测序或针对多个遗传相关基因谱的测序为遗传性消化道肿瘤的诊断和研究提供了大量信息[26]。对遗传性肿瘤家系进行高通量测序能发现传统检测方法未发现和(或)既往尚未报道的新致病性基因突变[27]。在具有消化道肿瘤遗传性高危家系中,利用NGS对多个相关遗传基因检测,可发现部分高危家系存在致病性的遗传基因突变,而这些突变根据现有的临床标准无法诊断[28,29]。此外,通过NGS也发现了一些新的与遗传性结直肠癌相关的基因。Palles等[29]通过全基因组测序发现POLE和POLD1两个基因和遗传性腺瘤病、遗传性结直肠癌均有比较明显的相关性。但既往研究却将部分携带POLE或POLD1基因突变的患者划归到与MMR缺陷相关的HNPCC患者群中[18]

四、NGS等基因检测技术在复杂和罕见的遗传性肿瘤中的研究和应用  除遗传性视网膜母细胞瘤、遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征这类遗传致病原因较明确、发病率相对较高的遗传性肿瘤以外,还有一些遗传性肿瘤相对罕见,病因更为复杂。因此,对于此类遗传性肿瘤的研究与常见遗传性肿瘤相比稍显滞后。NGS的范围广,数据量大,使其在科研和临床的应用都更灵活。通过目标区域捕获后的测序,不仅可以一次性检测多个与遗传性肿瘤相关的基因,还可以同时检测多种遗传性肿瘤的多个基因,对于疑似遗传性肿瘤患者,特别是如Lynch等家族中多人患多种肿瘤的、情况相对复杂、检测目标不明确的受检者更为适用。通过多基因或全基因组检测,可在患者中发现共同存在的基因突变,通过对这些突变基因的研究,有助于揭示这些罕见遗传性肿瘤的致病机制,发现遗传性肿瘤的致病基因或易感基因,为今后在临床开展基因检测提供依据。
        在临床应用中,我们发现有些遗传性肿瘤和遗传性疾病存在一定程度的交叉,这些疾病不仅与基因突变有关,也与染色体畸变有关。由于临床难以仅依据症状确定受检者患有何种疾病,通过基因突变确定患者的病因可能存在漏检或错检的情况。这一方面是由于某些遗传性肿瘤的研究仍处于起步阶段,目前仅能检测已知与疾病相关的基因,检测范围较小;另一方面是由于基因检测仅能检测基因发生何种变化,对于染色体异常引起的遗传性肿瘤或遗传性疾病并不完全适用,因此仅通过基因检测来判断受检者是否患病或是否具有患病风险存在一定的局限性,有漏检的可能。通过对4例表现出咖啡牛奶斑症状的患儿的检测,我们发现单纯检测是否携带遗传性致病突变存在一定的局限性。这4例患儿均在出生后即出现周身多处咖啡牛奶斑,疑似患遗传性神经纤维瘤、legius综合征或结节硬化症。对这4例患儿中的1例进行了遗传性神经纤维瘤的NF1及NF2基因、legius综合征的SPRED1基因、结节硬化症的TSC1及TSC2基因的高通量基因测序,并同时检测了染色体畸变情况,结果发现患儿虽存在染色体畸变,但通过查找文献和OMIM数据库比对,未发现此异常与临床症状或任何遗传性疾病存在关联;此患儿的基因测序结果显示存在NF1基因的致病突变。对患儿家属进行验证并未发现携带相同的致病突变,加之此患儿家族中未出现过类似患者,因此怀疑患儿发生了新发突变。对其余3例患儿基因测序,发现1例有疑似结节性硬化症家族史的患儿携带疑似致病突变,1例检出NF基因的疑似致病突变,另1例未检出携带任何突变。

五、讨论  临床应用中发现,NGS检测出大量遗传信息有很高的比率存在不能确定是否为有意义的变异。如何正确地解读这些数据需要多专业的交叉合作。同时,关于NGS检测遗传性肿瘤存在一定的争议,虽然并不是由于技术导致的,但在一定程度上反映了目前应用NGS开展科研和临床应用的现状。Slavin等[30]对美国9个月内在临床应用的商业化遗传性NGS芯片结果进行研究,发现如果只检测高风险基因(如BRCA1、BRCA2、MSH6、PMS2、TP53、APC、CDH1),结果只有6.2%的阳性率而不是17%,另外还有42%的未知突变可能是因为在检测中包含了较多的基因而对这些基因变异的机制及作用却知之甚少所致。这反映出遗传性肿瘤相关基因检测范围大小可对检测结果造成影响。虽然检测的基因多,意味着漏检的可能性相对小,但检测的基因数量多也意味着更为昂贵的检测费用,而且也尚不能确认这些基因是否和遗传性肿瘤的发生发展存在必然联系。
        精准医学建立在大数据平台的基础上,不同的人种由于基因型的差别,检测到的遗传性肿瘤相关基因也存在差别。因此,数据库的建立将为遗传性肿瘤的基因检测提供更多关于基因突变和易感基因的数据支持。对于那些家族中无癌症史的人来说,当发现一个意义未明突变,不能确认突变与肿瘤的关系时,数据库中收录的与此突变相关的信息将为意义未明突变做出更精准、更详细的分析。
        综上所述,NGS等基因检测技术将为遗传性肿瘤的研究和应用提供更好的检测方法。尽管仍存在一些质疑和问题,但随着数据库的建立和对遗传学研究的进步,将有更多的研究揭示与遗传性肿瘤相关的致病机制,并对筛选高危人群、实现遗传性肿瘤的早发现、早预防提供理论依据和检测手段。

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